miR-217靶向SPRY1调控血管内皮细胞增殖和凋亡的分子机制

张典文 王培翠 武文辉

(青岛市海慈医疗集团 1心血管二科，山东 青岛 266000；2功能检查科心电图室)

动脉粥样硬化(AS)通常会导致心脏病发作、脑卒中甚至死亡〔1，2〕。在动脉中有斑块形成时，流向某些器官的血液通常受到阻碍。目前AS与心血管疾病的发病机制密切相关，被认为是世界范围内的主要死亡原因〔3，4〕。miRNA为短链的非编码微小RNA，在机体多种疾病的发生发展中占重要地位〔5〕。据报道，miR-217在人类的多种癌症中均有表达，在心血管疾病中也有报道〔6，7〕，但具体的作用机制尚未十分清楚。软脂酰化磷蛋白Sprouty(SPRY1)可负向调控多种信号通路的调控，如MAPK、MAPK/ERK、FGF、EGF等〔8，9〕。SPRY1与miR-217在心血管疾病中的作用机制尚未清楚。本研究将构建高糖诱导的人脐静脉内皮细胞EAhy926损伤，检测其中miR-217、SPRY1的表达，探讨miR-217调控高糖诱导的EAhy926细胞进一步发展的功能机制。

1 材料与方法

1.1材料 人脐静脉内皮细胞EAhy926购自美国菌种保藏中心；改良都市培养基(DMEM)购自invitrogen；噻唑蓝(MTT)购自MCE；LipofectamineTM2000购自日本Takara；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore；RIPA蛋白裂解液购自南京建成生物研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自上海生工生物工程；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega。

1.2细胞培养 将人脐静脉内皮细胞EAhy926用混有血清的DMEM在常规条件下培养、传代。

1.3细胞模型的建立与分组 按照徐茂凤等〔10〕的方法，用25 μmol/ml高糖处理EAhy926细胞12 h为HG组。用5 μmol/ml高糖处理EAhy926细胞12 h为NG组。将anti-miR-con、anti-miR-217、pcDNA、pcDNA-SPRY1、anti-miR-217+si-con、anti-miR-217+si-SPRY1用3～5倍脂质体混匀，转染至EAhy926细胞，然后再用25 μmol/ml的高糖处理，分别为HG+anti-miR-con组、HG+anti-miR-217组、HG+pcDNA组、HG+pcDNA-SPRY1组、HG+anti-miR-217+si-con组、HG+anti-miR-217+si-SPRY1组，转染8 h后，添加培养基继续培养至48 h，用qRT-PCR确认转染效率良好，以用于后续试验。

1.4qRT-PCR实验检测miR-217、SPRY1表达 收集细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，将其作为模板用于qRT-PCR试剂盒检测miR-217、SPRY1表达。结果用2-△△Ct计算miR-217、SPRY1的表达水平。引物信息(5′-3′)：miR-217上游引物TGCCATGAAATAAATGTCTGTGC，下游引物AGGTGTTTTAGCATCTTGGGC；SPRY1上游引物GAGGCCAGAGCTCAGAGTGGCAAC，下游引物TGTTGGTTTTTCAAAGTTCCTAGG。内参U6和GAPDH的引物为常用引物序列，由上海吉玛公司合成。

1.5Western印迹实验检测细胞SPRY1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表达 收集细胞，提取总蛋白并变性后，取上清用于蛋白电泳，然后将蛋白用转膜仪转移到PVDF膜；将膜用2.5%脱脂奶粉封闭处理，加入Ⅰ抗(1∶500～1∶1 500)4℃过夜，再加Ⅱ抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。最后用ECL发光试剂盒显影曝光。蛋白条带的灰度表示蛋白的表达水平。

1.6MTT法检测细胞增殖 收集细胞，取约104个细胞置于24孔板中加入MTT反应溶液和二甲基亚砜(DMSO)溶液，在490 nm波长下检测细胞的吸光度(A)。

1.7Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 收集各组细胞，洗涤后用结合缓冲液悬浮，再加入Annexin V-FITC、PI各5 μL避光反应，上流式细胞仪检测凋亡情况。细胞的凋亡率为早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

1.8生物信息学分析 采用在线靶基因预测库 target scan(http：//www.targetscan.org/)网站预测miR-455-3p的靶基因。

1.9双荧光素酶报告基因实验验证miR-217与SPRY1的靶向结合 根据上述预测到的结合位点设计合成含有结合位点的质粒(SPRY1-WT)和突变序列(SPRY1-MUT)，送由吉玛公司完成。将SPRY1-WT、SPRY1-MUT克隆至荧光素酶报告载体psiCHECK2，构建荧光报告质粒。将其与miR-NC、miR-217共转染，然后检测细胞的荧光素酶活性。具体操作方法按照双荧光素酶报告基因实验检测试剂盒要求操作，记录萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，以二者的比值表示miR-217与SPRY1的结合力。比值越小结合力越强，比值越大结合力相对较弱。

1.10统计学处理 使用软件PEMS3.2进行单因素方差分析、SNK-q检验及t检验。

2 结 果

2.1高糖诱导对人脐静脉内皮细胞中miR-217和SPRY1表达的影响 与NG组比较，HG组miR-217发生明显升高，SPRY1 mRNA表达和蛋白表达均明显下调(P<0.05)。见表1,图1。

表1 miR-217和SPRY1在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中表达

图1 Western印迹检测人脐静脉内皮细胞SPRY1蛋白表达

2.2抑制miR-217调控高糖诱导对人脐静脉内皮细胞增殖 与NG组比较，HG组miR-217表达显著升高，细胞活性显著降低，P21蛋白表达明显降低(均P<0.05)；与HG+anti-miR-con组比较，HG+anti-miR-217组miR-217表达明显下调，细胞活性明显上调，P21蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图2和表2。

图2 Western印迹检测人脐静脉内皮细胞p53和p21蛋白表达

表2 干扰miR-217和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

2.3抑制miR-217调控高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡 与NG组相比，HG组细胞凋亡率明显上调，Bax蛋白表达明显上调，Bcl-2蛋白表达显著下调(均P<0.05)；与HG+anti-miR-con组比较，HG+anti-miR-217组凋亡率明显下调，Bax蛋白表达显著下调，Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.05)，见图3，图4，表3。

图3 流式检测细胞凋亡

图4 Western印迹检测凋亡相关蛋白

表3 干扰miR-217和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

2.4miR-217靶向SPRY1 运用target scan数据库预测到miR-217与SPRY1 3′UTR之间存在结合位点(图5)；miR-217明显抑制WT-SPRY1细胞的荧光素酶活性(P<0.05)，不影响MUT-SPRY1细胞的荧光素酶活性(P>0.05)；miR-217组SPRY蛋白表达(0.18±0.03)显著低于miR-con组(0.61±0.07);anti-miR-217组(0.88±0.09)显著高于anti-miR-con(0.64±0.06)，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图6，表4。

图5 miR-217靶向SPRY1 3′UTR的序列信息

图6 Western印迹检测人脐静脉内皮细胞SPRY1蛋白表达

表4 双荧光素酶报告实验

2.5过表达SPRY1调控高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖凋亡 与NG组比较，HG组SPRY1蛋白表达明显降低，细胞活性明显下调，细胞凋亡率明显升高，Bax蛋白表达显著上调，Bcl-2和p21蛋白表达明显下调(均P<0.05)；与HG+pcDNA组比较，HG+pcDNA-SPRY1组SPRY1蛋白表达明显上调，细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低，Bax蛋白表达明显下降，Bcl-2和p21蛋白表达均明显上升(均P<0.05)，见图7和表5。

图7 Western印迹检测人脐静脉内皮细胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白表达

表5 过表达SPRY1和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

2.6干扰miR-217和沉默SPRY1对高糖诱导人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响 与NG组比较，HG组SPRY蛋白表达下调，细胞活性下降，细胞凋亡率上升，差异均有统计学意义(P<0.05)；与HG+anti-miR-con组比较，HG+anti-miR-217组SPRY蛋白表达上升，细胞活性上调，细胞凋亡率下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与HG+anti-miR-217+si-con组比较，HG+anti-miR-217+si-SPRY1组SPRY蛋白表达下降，细胞活性降低，细胞凋亡率上升，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6和图8。

表6 干扰miR-217和沉默SPRY1对高糖诱导人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

2.7抑制miR-217联合沉默SPRY1调控高糖诱导人脐静脉内皮细胞增殖相关蛋白和凋亡相关蛋白 与NG组比较，HG组Bax蛋白表达上调，Bcl-2、p21蛋白表达下调，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与HG+anti-miR-con组比较，HG+anti-miR-217组Bax、Bcl-2、p21蛋白表达发生相反的调控，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与HG+anti-miR-217+si-con组相比，HG+anti-miR-217+si-SPRY1组Bax、Bcl-2、p21的蛋白表达发生与HG组相同的调控作用。见图9，表7。

图9 Western印迹检测人脐静脉内皮细胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白表达

表7 干扰miR-217和沉默SPRY1对高糖诱导人脐静脉内皮细胞SPRY1、Bax、Bcl-2和p21蛋白影响

3 讨 论

miRNA在人类的各种疾病中均具有重要的调控作用，包括心力衰竭、心肌梗死及心血管其他疾病〔11〕。miR-217参与多种肿瘤的发生发展，在心血管疾病中也具有重要作用。Zhang等〔12〕研究发现，miR-217在心脏黏液瘤中的表达异常降低，过表达miR-217可抑制癌细胞的增殖，促进凋亡，其作用机制与miR-217靶向调控白细胞介素(IL)-6的表达。刘宇等〔13〕研究报道，在高糖诱导的内皮细胞中miR-217的表达水平明显上调，可靶向与内皮细胞功能相关的多个靶基因的表达。本研究结果与刘宇等〔13〕研究结果相一致，进一步研究发现，抑制miR-217可促进高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖，抑制其凋亡，这是首次发现miR-217在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中的功能，为miR-217在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中的潜在价值的开发奠定基础；深入研究，验证了miR-217可靶向负调控SPRY1的表达，为miR-217在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中的调控机制的探索提供参考依据。

SPRY1为Spry 基因家族的一员，具有该家族的抑制血管生成作用〔14，15〕。Friesel等〔16〕报道，SPRY1上调可抑制人脐静脉内皮细胞Matrigel上的管形成、抗血管生成因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂f1。Yang等〔17〕报道，Spry1对MAPK/ERK信号传导几乎没有影响，但在血管平滑肌细胞中增加并维持Akt活化，体外血管平滑肌细胞标志物表达需要持续的Akt信号传导，而ERK信号传导负调节Akt活化和血管平滑肌标志物基因表达。Lu等〔18〕通过ApoE建立小鼠血管内皮细胞损伤模型，SPRY1在AS组织中的表达水平明显降低，且可作为miR-29b的靶基因调控人脐静脉内皮细胞的炎性因子表达及MAPK信号通路的活性，提示miR-29b/SPRY1/MAPK信号通路具有治疗AS的潜力。本研究结果与前人研究结果均相一致；过表达SPRY1后，具有与抑制miR-217表达对高糖诱导的损伤的内皮细胞的增殖促进和凋亡抑制的相同作用，这与SPRY1在AS中的抗炎保护作用相呼应，为SPRY1的功能研究提供了新的理论参考；深入研究发现，沉默SPRY1可逆转抑制miR-217对高糖诱导人脐静脉内皮细胞的增殖促进和凋亡抑制作用，说明不仅miR-217可靶向抑制SPRY1的表达，SPRY1也可逆向负调控miR-217对高糖诱导人脐静脉内皮细胞的表达和功能。

综上，抑制miR-217可促进高糖诱导人脐静脉内皮细胞的增殖，抑制其凋亡，产生这种作用的机制与miR-217靶向负调控SPRY1的表达有关，为糖尿病心血管疾病的治疗提供新方向。