肾茶黄酮预防急性肾缺血模型大鼠再灌注损伤作用及其机制

郭银雪 葛平玉 詹继红

(贵州中医药大学第一附属医院 1肾内科，贵州 贵阳 550001；2泌尿外科)

急性肾损伤是多种因素引发的肾功能急剧快速下降综合征，而肾脏缺血则是急性肾损伤发生的重要原因之一〔1,2〕。对急性肾缺血再灌注损伤进行防治可能有助于减少急性肾缺血再灌注引发的急性肾衰竭及其相关不良预后。肾茶已被证实在急慢性肾炎、泌尿系统结石疾病、感染疾病等泌尿系统疾病治疗中可取得良好效果〔3,4〕。因此，推测肾茶提取物肾茶黄酮应用于急性肾缺血再灌注损伤可能有效。因此，本研究采用肾茶提取物肾茶黄酮进行急性肾缺血大鼠模型再灌注损伤的治疗，观察了其对肾功能、氧化应激等的影响及其可能机制。

1 资料与方法

1.1实验动物 以48只SPF级SD大鼠为研究对象，均购自贵阳医学院提供实验动物中心，购买后均单笼适应性饲养1 w，饲养条件为温度维持在22～25℃，相对湿度维持在50%～60%，正常进行光照，期间注意保持空气流通，大鼠均自由饮水和摄食。饲养的笼子进行编号并在笼子上标注说明，根据随机数表，将饲养的大鼠分为研究组(n=24)和对照组(n=24)。研究符合伦理学标准并经医院伦理学委员会审核批准。两组基线资料比较无明显差异(P>0.05)，有可比性，见表1。

表1 两组基线资料比较

1.2仪器和试剂 标准大鼠颗粒饲料由贵阳医学院实验动物中心提供，艾本德5424离心机购于德国艾本德公司，恒温箱购于南京泰斯特试验设备有限公司，超低温冰箱购于青岛海尔特种电器有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所，德国欧宝xl-600 全自动生化分析仪购于北京瑞博泰克生物科技有限公司，Bax单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体购于艾美捷科技有限公司，Bax 二抗、Bcl-2二抗均购于美国CST中国分公司，显微镜购于上海光学仪器厂，微量移液器购于德国艾本德公司，血肌酐检测试剂盒购于北京博迈斯科技发展有限公司，人肾损伤分子(KIM)-1检测试剂盒购于上海研卉生物科技有限公司。

1.3实验方法

1.3.1肾缺血再灌注模型建立 两组适应性饲养1 w后均制造为肾缺血再灌注模型，具体操作如下：术前1 d大鼠均禁食1个晚上，对手术操作台及器械进行严格消毒，采用50 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，确认麻醉适宜后绑起大鼠四肢并固定于操作台。于大鼠腹部正中处行一长约3 cm的纵向切口，显露右肾及肾蒂，常规行右肾切除，并无损伤左肾动脉夹闭1 h后松开血管。确认肾脏灌注良好后缝合关闭切口。

1.3.2干预方法 研究组在再灌注24 h开始腹腔注射0.1 g/ml肾茶黄酮配比液2 ml，每12 h 1次，2次/d。对照组同期腹腔注射等量0.9%生理盐水。肾茶黄酮配比液的制作方法如下：取肾茶药材以粉碎机粉碎后过10目筛备用，取5 g粉末，以乙醇为提取溶剂进行回流提取，提取结束后将提取液蒸干并称重，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测得总黄酮含量〔5〕，并以0.9%生理盐水配置成0.1 g/ml肾茶黄酮配比液。

1.3.3指标检测 再灌注24 h、48 h、72 h、96 h分别随机处死大鼠6只。取各组大鼠肾组织常规制成石蜡切片，检测时将石蜡切片常规进行脱蜡水化处理，一抗为兔抗大鼠Bax或Bcl-2多克隆抗体(1∶50稀释)，二抗为生物素化羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(1∶100稀释)，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，二氨基联苯胺(DAB)显色，随意取5个高倍视野进行染色观察，以超过20%细胞出现棕黄色或棕褐色染色为阳性,Bax和Bcl-2均染色定位于胞质。心脏采血4 ml常规进行离心和取血清冷藏待测处理，血清丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸比色分析法，SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法，血清肌酐(SCr)、KIM-1等肾功能指标水平等各血清指标的检测均采用全自动生化分析仪，具体检测操作严格按照仪器及试剂盒的说明进行。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、两独立样本均数t检验、Spearman相关分析、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1两组肾功能变化比较 两组灌注24 h组肾功能比较无明显差异(P>0.05)。与对照组比较，研究组灌注48 h、72 h、96 h的血清SCr、KIM-1等肾功能指标水平显著降低(P<0.05)，见表2。

2.2两组肾组织Bax、Bcl-2蛋白阳性表达率变化比较 两组灌注24 h组肾组织Bax、Bcl-2蛋白阳性表达率比较无明显差异(P>0.05)。与对照组比较，研究组灌注48 h、72 h、96 h的肾组织Bax蛋白阳性表达率显著升高，而同期肾组织Bcl-2蛋白阳性表达率显著降低(P<0.05)，见表2。

2.3两组血清氧化应激指标水平变化比较 两组灌注24 h组血清氧化应激指标水平比较无明显差异(P>0.05)。与对照组比较，研究组灌注48 h、72 h、96 h的血清SOD活力水平显著升高而同期血清MDA水平显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 两组不同时间点肾功能、肾组织Bax、Bcl-2蛋白阳性表达率、血清氧化应激指标水平比较

2.4研究组血清SCr、KIM-1水平与Bax、Bcl-2蛋白阳性表达率的关系 研究组血清SCr、KIM-1水平与Bax蛋白阳性表达率呈负相关(r=-0.792，-0.831，P<0.05)，与Bcl-2蛋白阳性表达率则呈正相关(r=0.805，0.879，P<0.05)。

2.5研究组血清SCr、KIM-1水平与血清SOD活力、MDA的关系 研究组血清SCr、KIM-1水平与血清SOD活力水平呈负相关(r=-0.811，-0.842，均P<0.05)，与血清MDA水平则呈正相关(r=0.863，0.795，均P<0.05)。

3 讨 论

肾脏是高灌注器官，其血流量达到心脏的1/4，对缺血和缺血再灌注损伤十分敏感〔6,7〕。肾缺血再灌注损伤是急性肾损伤的常见病因，急性肾缺血再灌注损伤可导致肾脏血流量的明显减少、肾小球滤过功能降低、肾小管功能堵塞等，这些因素均可导致肾脏缺血缺氧及其相关病理改变的发生〔8～10〕。本研究结果显示，急性肾缺血再灌注损伤发生后肾功能损伤明显，若无及时有效干预可能进一步引发肾衰竭而危及生命安全。因此，对急性肾缺血再灌注损伤进行及时有效的防治十分重要。

研究表明肾茶在急慢性肾脏疾病中均可取得较好的效果，可提高免疫力，改善肾功能等，且其低毒安全，临床推广具有良好基础〔11,12〕。本研究证实了肾茶在肾脏疾病中的应用效果，这与张少贵等〔13〕的研究结果一致。Bax、Bcl-2均与肾组织细胞凋亡损伤密切相关〔14〕。因此，肾茶黄酮可能通过抑制急性肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织细胞凋亡而达到改善其肾功能的目的。SOD活力和MDA均为反映氧化应激状态指标〔15,16〕。因此，肾茶黄酮可能通过降低急性肾缺血再灌注损伤大鼠氧化应激反应而达到其保护肾功能的目的。然而基于本研究样本量偏小、观察时间较短等，肾茶黄酮对急性肾缺血再灌注损伤大鼠肾功能的影响及其可能机制尚需进一步大样本量的研究证实。

本研究提示肾功能状况可能与肾组织细胞凋亡损伤及氧化应激损伤状况密切相关，急性肾缺血再灌注损伤肾功能受肾组织细胞凋亡损伤及氧化应激状态的影响，从而进一步证实了抑制肾组织细胞凋亡损伤及改善氧化应激状态干预可改善性肾缺血再灌注损伤肾功能的可能性。

综上所述，肾茶黄酮预防急性肾缺血模型大鼠再灌注损伤效果良好，其机制是可能通过调控Bax和Bcl-2表达及降低氧化应激反应达到预防急性肾缺血再灌注损伤作用，肾茶黄酮可能作为急性肾损伤防治药物。