矿源黄腐酸与生化黄腐酸热裂解组分的对比研究

王 智 张惠芬 秦 谊 李宝才 张 敉

昆明理工大学生命科学与技术学院 昆明 650500

黄腐酸是腐植酸类物质的三大组分之一[1～3]，具有活性官能团多、水溶性较好等优点。研究表明，黄腐酸生物功能众多，如降低小麦对重金属元素铬的吸收，促进豆类植物运输磷酸盐和铁离子，促进盐胁迫条件下树木、小麦、烟草的生长[4～7]。实践证明，黄腐酸在改良土壤、提高化肥利用率、提高作物抗逆性等方面有稳定可靠的效果[8～10]。除了农业上的应用，黄腐酸也在医药、环境、畜牧业等领域中广泛应用[11～13]。目前，关于黄腐酸的研究主要集中于其化学组成与功能评价。其中，化学组成是基础和关键，直接影响着活性机制的阐明与黄腐酸系列产品的深度开发。

热裂解是在急剧升温的条件下，将大分子样品裂解成小分子碎片后进行分析的方法[14]。将其与气相-质谱分析方法串联使用，可有效探究碎片化后挥发性小分子的化学结构，从而提供成分组成信息及被分析大分子的物质组成特征等。Stefanova等[15]通过对欧洲褐煤腐植酸的还原热解分析，推测组成腐植酸的基本结构单元是含有杂原子的1 ～2 个芳香稠环。Schellekens 等[16]使用热裂解-气相色谱-质谱（Py-GC-MS）法，比较了不同来源腐植酸及黄腐酸的分子结构、化学组成，分析样本来源比较全面，包括了矿物、土壤、河流等。结果显示：热裂解的主要产物为碳水化合物、酚类、苯、木质素酚类化合物，占所有定量热解产物的62%～96%。因此分析表明，黄腐酸的芳香程度不如腐植酸整体的芳香程度高。Baigorri 等[17]利用热裂解分析发现：与其他腐植酸类物质相比，土壤和褐煤中的黄腐酸包含芳香族结构更小且含氧基团更多的结构单元。

工业化生产方面，矿源黄腐酸的主要原料为泥炭、褐煤和风化煤[18～20]，而生化黄腐酸主要利用微生物发酵从植物废料中提取。由于矿物和植物差别巨大，而矿物本身也因成煤时间、成煤植物、矿区环境等各种因素导致成分迥异。因此，即便制备方法相同，来源不同也会造成黄腐酸的物质组成产生差异[21，22]。为进一步对比研究不同制备原料对黄腐酸物质组成的影响，本研究采用Py-GC-MS法分别对从不同产地的泥炭、褐煤和风化煤中提取的黄腐酸进行了热裂解产物分析，同时对比了生化黄腐酸的热裂解组分，以期为矿源黄腐酸化学研究提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

提取矿源黄腐酸所用的泥炭、褐煤和风化煤分别来源于云南会泽、峨山，黑龙江宝清以及新疆托克逊地区煤矿。具体采样地点和原料种类见表1。

生化黄腐酸（甘蔗糖蜜提炼后液体发酵液，发酵程度不详）购自广西淼鼎生物科技有限公司。

表1 煤源地理位置Tab.1 The location of the coals

1.2 矿源黄腐酸的制备

利用过氧化氢氧化法分别从以上煤样中提取黄腐酸，具体过程见Qin 等[9]的方法。

1.3 实验仪器

热裂解仪（CDS5000，美国），分析天平（AB204-S，METTLER-TOLEDO 瑞 士， 精 度0.1 mg），热裂解装置专用石英管（CDS，美国），固相微萃取头（75 μm Carboxen-PDMS，Supelco，美国），气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪（6890A/5973C，Agilent，美国），HP-5MS色谱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent，美国）。

色谱条件：进样口温度，280 ℃；载气，He；流速，1.0 mL/min；分流比，10 ∶1；升温程序，50 ℃（2 min）-10 ℃/min-140 ℃（1 min）-10 ℃/min-280 ℃（1 min）。

质谱条件：GC-MS 接口温度，280 ℃；离子源，EI 源；电子能量，70 eV；扫描范围，29 ～500 道尔顿；标准图谱库，NIST-14。

裂解温度：600 ℃下热裂解；裂解时间：10 s；裂解氛围：氮气。

1.4 实验方法

分别称取约5 mg 矿源黄腐酸或生化黄腐酸加入到裂解石英管中间位置，然后将石英管装入热裂解仪，分别在氮气氛围中的600 ℃下进行热裂解，热裂解产物用裂解瓶收集。热裂解完成后将固相微萃取头置于裂解瓶中对热裂解产物进行萃取，萃取时间为30 min，萃取温度为80 ℃。然后将固相微萃取进样针插入气相色谱的进样口中进行解吸附，时间为2 min。热裂解产物进入GC-MS 联用仪进行分离与鉴定，并根据色谱峰面积，对鉴定物质的相对含量进行了分析。

1.5 数据处理

矿源黄腐酸与生化黄腐酸的总离子流色谱图是色谱-质谱法测得的各种质荷比的离子总数随时间变化的曲线。通过Data Analysis 软件将色谱峰自动积分，通过NIST-14 标准图谱库对每个色谱峰的质谱图进行检索，鉴定黄腐酸的热裂解产物，并对匹配度大于80%且相对含量较多的热裂解产物列表。

2 结果与分析

图1 ～图5 为不同矿源黄腐酸与生化黄腐酸的Py-GC-MS 图，表2 为不同来源黄腐酸匹配度大于80%且相对含量较多的热裂解产物。我们通过预实验发现：与300、500、700 ℃相比，600 ℃下的热裂解产物能给出较多的碎片信息，且重排产物较少。因此，本实验的热裂解温度为600 ℃。结合图1 ～图5 及表2，矿源及生化黄腐酸的热裂解产物随保留时间增加呈现出简单到复杂的趋势，结构类型依次为醛酮、苯环或杂环、稠环化合物。矿源黄腐酸的热裂解组分保留时间大部分小于15 min。

所鉴定的会泽、宝清、峨山、托克逊矿源提取的黄腐酸及生化黄腐酸的热裂解产物（表2）占总热裂解产物的39.7%、41.3%、33.6%、34.8%及21.4%，相对含量较高的物质分别是糠醛、乙酸、乙酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。矿源黄腐酸的热裂解产物主要有乙酸、苯、吡咯、甲苯、糠醛、苯酚、苯并呋喃、丁二酰亚胺、邻苯二甲酸二异丁酯等物质；矿源产地不同，所提取的黄腐酸的热裂解产物也大不相同，以糠醛为例，其在会泽泥炭、宝清褐煤、峨山褐煤、托克逊风化煤提取的黄腐酸中含量分别为8.509%、1.989%、6.819%、0。

图1 会泽泥炭中黄腐酸的Py-GC-MS 图Fig.1 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from peat in Huize

图2 宝清褐煤中黄腐酸的Py-GC-MS 图Fig.2 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from lignite in Baoqing

图3 峨山褐煤中黄腐酸的Py-GC-MS 图Fig.3 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from lignite in Eshan

图4 托克逊风化煤中黄腐酸的Py-GC-MS 图Fig.4 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from weathered coal in Tuokexun

图5 生化黄腐酸的Py-GC-MS 图Fig.5 Py-GC-MS diagram of biodegradable fulvic acid

表2 不同来源黄腐酸的热裂解产物Tab.2 Pyrolytic compounds of fulvic acid from different sources

表2 续

矿源黄腐酸及生化黄腐酸的共有物质是吡咯及苯酚。与矿源黄腐酸相比，生化黄腐酸的热裂解产物中稠环芳香族化合物的含量较高。表2 中生化黄腐酸热裂解产物除2-丁烯醛（E）、吡咯、糠醛、苯酚、对甲酚、丁二酰亚胺外，其余物质都是矿源黄腐酸所没有的，并且都是稠环芳香性化合物。

3 结论与讨论

本实验使用固相微萃取装置将裂解气收集，通过GC-MS 联用仪对热裂解产物进行半定量分析。由于大分子化学键断裂生成的小分子结构不稳定，在断裂的时候某些小分子可能进行了重排。因此，热裂解检测到的化合物不一定是原本黄腐酸大分子中存在的分子片段。高温下小分子含氧化合物可以生成烯烃、酸酐或酯，共轭二烯烃与不饱和化合物可发生1，4-加成反应，生成环状化合物。多数热裂解产物难以发生环加成反应，热裂解产物中的芳香化合物可能多数是原本大分子中固有的。由于黄腐酸组成物质的分子量分布广泛，结构复杂，而所需能量相差不大的化学键断裂可能是随机的，因此相同种类化合物的结构取代基也有许多差异，这些化合物有可能是相似的结构碎片重排产生的。

运用Py-GC-MS 法，能够通过解析热裂解组分而得到黄腐酸组成物质的分子片段信息。González-Pérez Martha 等[23]通过对土壤中的腐植酸热裂解的特征分析，发现其组成受到土壤中原来的植物组成的影响。本研究中，600 ℃下矿源黄腐酸的热裂解产物主要是脂肪族化合物以及单环芳香化合物，推测黄腐酸本身物质组成结构中应该含有芳香苯环或杂环结构片段，而这些芳香片段之间可能通过脂肪族碳链连接，而芳香苯环或杂环以及脂肪链上应分布有羰基、羟基、羧基、醛基、氨基等官能团。不同矿源的黄腐酸热裂解产物差异明显，而矿物来源与生化来源的黄腐酸差异更是显著。与矿源黄腐酸相比，生化黄腐酸的热裂解产物中含氧脂肪族化合物含量较低，而稠环芳香族化合物的含量较高。

生化黄腐酸是应用现代生物技术，以植物残渣为原料，经生物发酵制取的黄腐酸类物质。它的性能与矿源黄腐酸类似，价格却较低。原料不同必然造成矿源黄腐酸与生化黄腐酸的化学组成差异。黄腐酸的物质组成是黄腐酸发挥不同功能的基础。根据热裂解组分比较结果，说明了黄腐酸的物质组成受到原料及产地的极大影响而出现显著差异。因此，无论是黄腐酸的物质组成，还是功能研究中，原料及产地都是产品研究中的重要考察环节及因素。