追施光合细菌与猪场粪污对生菜生长效果的研究

赵芮晗，张欢，卢海凤，李保明，施正香

(1.中国农业大学水利与土木工程学院，北京 100083；2.农业农村部设施农业工程重点实验室，北京 100083；3.北京畜禽健康养殖环境工程技术研究中心，北京 100083)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试猪场粪污 本试验所用猪场粪污取自山东某公司的养猪场粪污处理工程中厌氧工艺出水(沼液，下文称猪粪沼液)与厌氧出水再经好氧工艺处理后的出水(好氧池出水)。粪污特性如表1所示。

表1 供试粪污特性Table 1 Characteristics of test feces mg·L-1

1.1.2 供试菌种 PSB种属为沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonaspalustris)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)和类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的混合菌种，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC NO.1.8929、CGMCC NO.1.3366、CGMCC NO.1.5028。采用HCH培养基[21]培养至对数生长期使用。

1.1.3 生菜与底肥 选择两种典型的生菜幼苗：红罗莎生菜幼苗和超级大速生生菜幼苗，苗龄均为20 d，购于中农富通通州科技园。底肥为化肥，每个盆栽含尿素4.62 g，磷酸二氢钾1.54 g，氯化钾2.38 g，购自北京碧绿佳园无土栽培有限公司。

1.1.4 营养液 采用1/2 Hoagland’s营养液[22]作为追肥的空白对照组。其中含有氮元素210 mg·L-1,磷元素31 mg·L-1。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将两种供试废水的pH调至6.8～7.0，以保证PSB正常生长。将供试细菌种子液按1∶1∶1的比例接种于两种猪场粪污中，接种PSB干质量浓度为0.23 g·L-1。培养条件为自然光(500～20 000 lx)，温度为28 ℃，溶解氧质量浓度为0.5～1.0 mg·L-1，培养5 d即获得两种新型的PSB-猪粪粪污混合菌肥，其各项指标如表2所示。

表2 试验用菌肥氮磷含量Table 2 Nitrogen and phosphorus content of bacterial fertilizer for experiment

取500 mL猪粪沼液稀释1.2倍，加入93.26 mg硝酸钾，使其中的N、P含量与空白对照组一致。取500 mL好氧池出水，稀释1.28倍，加入685.2 mg硝酸钾，使其中的N、P含量与空白对照组一致。不同品种生菜幼苗采用盆栽方式，每盆装 3.5 kg基质，定植前将基质浇透水，以能手捏成团，掉落散开为标准；每盆均匀拌入化肥作为底肥，追肥设置为不同处理，采用单因素试验设计(表3)，每个处理重复5次，所有组别每12 d按操作方式进行根灌，共追肥 2 次，每次每盆施用500 mL。各处理浇水至土壤持水量的75%以上，每盆移栽5株长势基本一致的生菜幼苗，生长期间定期浇水、松土和依次轮换盆的位置，其余时间用清水进行日常照料，各组清水浇灌量保持一致，为每盆500 mL，生菜幼苗在移栽后28 d进行采收。试验时间2018年11月26日至12月20日，在玻璃日光温室中进行，试验区域面积6 m2，11月26日定植，分别于12月8日、12月20日各根灌1次追肥。12月24日采样并开始测产。

表3 盆栽试验设计表Table 3 Table of pot experiment design

1.3 分析方法

1.3.1 生菜农艺性状 试验结束后，测量两种供试蔬菜的株高、叶宽、地上部鲜质量及地上部干质量。株高及叶宽通过人工直尺测量得出；地上部鲜质量通过直接称重得出；将地上部分置于105 ℃烘箱3 h，再调整温度为80 ℃烘至恒重并冷却称重，以获得地上部干质量[23]。

1.3.2 生菜光合指标 定植后28 d采收，每个处理组选取5株生菜生长的最旺盛叶片，采用便携式光合测量仪测定净光合速率。用质量分数为80%的丙酮和95%的乙醇混合浸提法测定叶绿素[24]。

东半壁店小流域内已建有污水处理厂1处，位于东半壁店村，该污水处理厂近期污水处理规模为1.5万m3/d，采用改良氧化沟污水处理工艺和机械浓缩脱水污泥处理工艺，处理后污水受纳水体为官沟。污水处理厂设计出水水质为Ⅱ级标准。

1.3.3 生菜品质指标 试验结束后，测定两种供试蔬菜的品质指标，包括硝酸盐、可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C含量。硝酸盐含量采用水杨酸分光光度计法测定[25]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[25]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色分光光度法测定[25]；维生素C含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[25]测定。

1.3.4 生菜安全指标 安全指标为重金属含量与微生物含量，按照《食品安全国家标准》中铅[26]、镉[27]、汞[28]、大肠杆菌[29]和沙门氏菌[30]的标准测定方法测定。

1.3.5 数据分析 使用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析和差异显著性分析(P<0.05)，并使用Origin 2017作图。

2 结果与分析

2.1 混合菌肥对生菜农艺性状的影响

PSB能显著提高红萝莎生菜的株高，在营养液中添加了PSB的T1处理组比空白对照组(CK)的株高提高23.11%，但T2、T3处理组与T1处理组之间差异不显著。对于超级大速生生菜，株高由高到低顺序为T2>T3>T1>CK，且各组之间差异显著。T2处理组株高可达到22.02 cm，比T1处理组提高21.59%，猪粪沼液对株高的促进作用优于营养液。

除株高外，红罗莎生菜的T1与T2，以及T1与T3之间的差异显著。对于红罗莎生菜，T1比CK的叶宽提高了11.45%，且T2及T3的叶宽显著性优于T1。如表4所示，每种生菜的地上部鲜质量、干质量，各处理组间差异显著。且T2处理组对于提高供试蔬菜重量效果最明显，其效果显著优于T1处理组。红罗莎生菜T2处理组的干质量与鲜质量分别比CK提高50.78%与59.09%。对于超级大速生生菜，其T2处理组的干质量与鲜质量分别比CK提高38.18%与48.58%。

表4 不同处理组对生菜农艺性状的影响Table 4 Effect of different treatment groups on agronomic characters of lettuce

2.2 混合菌肥对生菜光合指标的影响

红罗莎生菜中的叶绿素含量由高到低顺序为T2>T3>T1>CK，超级大速生生菜的叶绿素含量由高到低为T2>T3>T1>CK。其中，超级大速生生菜的叶绿素总量最高达到0.79 mg·g-1，比CK提高27.42%。

另外，红萝莎生菜与超极大速生生菜净光合速率最高的处理组均为T2，两蔬菜中该组净光合速率分别比CK提高了24.97%与25.15%。T2与T1之间差异显著，进一步证明猪粪沼液+PSB能够显著提高植物生长活性。

表5 不同处理组对生菜光合指标的影响Table 5 Effect of different treatment groups on photosynthetic indexes of lettuce

2.3 混合菌肥对生菜品质指标的影响

图6表明，对于红罗莎生菜，添加了PSB的处理组中硝酸盐含量比CK低12.83%～14.61%；对于超级大速生生菜，添加了PSB的处理组中硝酸盐含量比CK低14.04%～15.23%。

可溶性糖含量最高的处理组为T2，可达21.07 g·kg-1(红萝莎生菜)和21.53 g·kg-1(超极大速生生菜)，含量最低的处理组均为CK。对于红罗莎生菜，可溶性糖含量由高到底排序为T2>T3>T1>CK，分别比CK提高了22.00%、21.42%和15.63%。对于超级大速生生菜，各处理组的可溶性糖比CK提高18.71%～25.91%。

2种生菜中可溶性蛋白含量最高的处理组均为T2组，分别可达到15.92 mg·g-1(红萝莎生菜)与16.61 mg·g-1(极大速生生菜)，最低处理组均为CK。对于红罗莎生菜，T3和T1组的结果之间差异不显著，进一步正证实了T2处理组中猪粪沼液+PSB的联合作用效果优于其他处理组。

对于两种供试蔬菜，最高维生素C含量均出现在T2组，可达0.248 mg·g-1(红萝莎生菜)以及0.263 mg·g-1(超级大速生生菜)。红罗莎生菜、超级大速生生菜含PSB的处理组中维生素C含量比自身CK组分别提高了4.55%～25.25%和6.10%～23.47%，且T1、T2、T3之间差异显著。

表6 不同处理组对生菜品质指标的影响Table 6 Effect of different treatment groups on quality index of lettuce

2.4 混合菌肥对供试生菜安全指标的影响

生菜食品安全指标主要包括重金属与微生物含量两大类。根据上述的试验结果，超级大速生生菜的总体表现优于红罗莎生菜，故选择其作为安全性指标的试验对象。按照中国国家食品安全标准 《GB 5009.12—2017》《GB 5009.17—2014》《GB 5009.15—2014》要求新鲜叶菜中(即叶菜鲜质量FW)铅的检出量≤0.3 mg·kg-1，镉的检出量≤0.2 mg·kg-1，汞的检出量≤0.01 mg·kg-1。表7统计了不同处理组超级大速生生菜中所含重金属的量。由表7可知，生菜的4个处理组中，铅、汞、镉3种重金属含量均未超标。虽然CK组中Cd与Hg也有检出，但数值远低于国家标准检出限。CK组中的重金属可能是由于基质土本身或购买的生菜幼苗根部原土带来的。

表7 不同处理组超级大速生生菜中的重金属含量 Table 7 Contents of heavy metals in super fast-growing lettuce of different treatment groups mg·kg-1

按照中国国家食品安全标准《GB 4789.3—2016》《GB 4789.4—2016》的要求，表8统计了不同处理组生菜中两种微生物的数量。按照标准，要求致病菌(沙门氏菌)不得检出，大肠杆菌数≤150 MPN·100 g-1。由表8可知，生菜的4个处理组均未检出致病菌沙门氏菌，但好氧出水PSB处理组生菜中大肠杆菌数最多且超过限额，不符合食品安全标准。CK组中检测出大肠杆菌，可能是由于基质土本身或采购的生菜苗根部原土带来的。

表8 不同处理组超级大速生生菜中2种微生物含量Table 8 Content of two kinds of microorganism in super fast-growing lettuce of different treatment groups MPN·100 g-1

3 结论与讨论

PSB可以在有效降低废水中污染物含量的同时产出具有脯氨酸、尿嘧啶等活性物质的高价值菌体，用以提高植物产量且改善植物品质[18]。猪场粪污经PSB处理后，N、P含量达到了适宜生菜生长的范围，且粪污中含有的微量元素及生物活性物质有利于生菜的种植。

王素英等[31]对1989年至2002年中国生产应用的微生物肥料综合分析得出，PSB类肥料对农产品的增产效果约为15%。赵彩霞等[32]将PSB与培养基做成不同配比的菌剂，施用于水培不结球生菜，发现与纯培养基相比，添加了PSB的处理组可以提高生菜产量，最优处理组增产19.32%，15 mL·L-1光合菌剂+10 mL·L-1培养基的处理组降低硝酸盐效果最为显著，相比纯PSB培养基的对照组下降了30.39%。小区田间应用试验显示，经PSB菌肥处理的生菜增产28.8%[33]。本试验中两种供试生菜的T2处理组地上部鲜质量、干质量平均提高了53.85%和44.48%，远超前期研究结果，可见猪场粪污的配施对于生菜有着重要的营养供给作用，结果优于单独施加PSB。叶绿素总量的多少与植物光合作用的强弱密切相关。试验结果表明，添加PSB的试验组叶绿素含量更高，原因可能是，PSB刺激作物分泌氨基乙酰丙酸，而该物质是合成叶绿素的重要成分，最终刺激了植物叶绿素的产生[34]。彭桂香等[35]采用盆栽方式探究PSB追肥对生菜生长影响的试验，PSB菌剂处理组获得的最高叶绿素总量达0.404 mg·g-1，比其试验中的营养液处理组提高了8.31%，但提升效果大大逊于本试验中的配施结果，本试验中生菜叶绿素最高可达0.79 mg·g-1，相比CK提高27.42%。PSB促进了植物叶绿素的生成，从而提高了植物的光合速率，所以本试验中添加PSB的处理组净光合速率更高。这与夏宏等[36]的研究结果一致，以有机肥为底肥，向油菜喷施PSB后，光合速率提高了24.8%。梁飞虹等[37]研究采用稀释法用以降低沼液中氨氮对生菜生长的影响，研究结果表明，将经过减压脱氮预处理后的沼液稀释5倍时，生菜中叶绿素含量高于空白对照组。相比于该试验中复杂的沼液减压脱氮预处理技术，本试验利用PSB吸收利用氨氮的特性来降低猪粪沼液中氨氮含量，方法更为简单快捷，且可回收利用菌体，节约水资源与处理成本。本研究结果表明，PSB有着降低生菜中硝酸盐的作用，这对于保护人体健康意义重大。PSB将硝酸盐作为电子受体,通过硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用，把硝酸盐还原成氨基酸或氮气释放出去，从而降低蔬菜中的硝酸盐含量[33]。同时，沼液中的硝态氮占比极小，所以将其作为肥料施用时，安全性高于以硝态氮为主要氮源供给的营养液，有着降低植物体内硝酸盐的作用。林阿典等[38]在水培直叶生菜研究中，对比了不同稀释倍数的猪粪沼液和营养液水培生菜的效果，结果发现，施用沼液的处理组硝酸盐含量显著降低，可达158.34 mg·kg-1，比其试验中纯营养液对照组降低79.44%，且维生素C含量比纯营养液处理组提高38.04%以上。在蔬菜叶面喷施光合细菌菌剂的大田试验中，PSB对于生菜的可溶性糖、维C含量的提高以及硝酸盐的降低，均有积极意义。在盆栽试验中，彭桂香等[35]以化肥为基肥，使用PSBsbg11菌剂作为追肥施用于生菜后，生菜的维生素C含量得到了显著提升，比营养液处理组提高了8.31%，但可溶性糖含量在组间未形成显著差异，效果逊于本试验PSB与猪粪沼液配施(T2)的结果。本试验还存在一些局限性，例如可以考察将猪粪沼液+PSB、好氧出水+PSB混合菌肥制备完毕后不经过N、P调整直接进行追施的效果，进而简化操作步骤。

本研究将PSB用于猪场粪污处理并利用形成的混合菌液作为追肥用于两种常用生菜的培养。结果表明，在1/2 Hoagland’s营养液中添加PSB能够使肥效在多方面得以提升，追肥效果优于纯1/2 Hoagland’s营养液，当猪场粪污经过PSB处理后以混合菌液形式作为追肥时，往往能够获得比1/2 Hoagland’s营养液+PSB更优的追肥效果。综合而言，猪粪沼液+PSB为最优追肥，能够显著提高供试蔬菜的生长、生理生化代谢活性与品质，且能显著降低硝酸盐含量，提高可溶性糖、蛋白与维生素C含量，并符合食品安全标准。说明以后利用其代替化肥、减施化肥追肥的可行性很大。且对于整个畜禽养殖业而言，猪粪污水PSB液肥化技术，不仅可制成环境友好型生物肥料，又可将粪污资源有效利用，有助于畜禽养殖业的可持续性发展。