缓释配方肥提升胡椒果实灌浆的机制研究

祖超，李文平，李志刚，王灿，鱼欢，郑维全，杨建峰

(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南 万宁 571533；2.农业农村部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室，海南 万宁 571533；3.海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室，海南 万宁 571533)

胡椒(PipernigrumL.)被誉为香料之王，是世界热带地区重要经济作物。因全球热带地区有限，世界胡椒市场长期存在需求旺盛与供应不足问题，中国供需矛盾更加突出[1]。增产是解决胡椒产业主要矛盾的关键。目前生产上常用的增产手段是施肥促花促果，这种技术施肥量大，所用氮、磷和钾肥的量分别是胡椒需肥量的2.6、21.6和2.9倍，但是产出只有目标产量的40%。这种过量施肥的手段，造成土壤和胡椒的污染，有悖于胡椒产业绿色发展。研究科学施肥调控胡椒生殖生长，对于提高胡椒产量和研发绿色增产技术具有重要意义。缓释肥料是一种绿色污染小的环境友好型肥料，具有利用率高、肥效长、施用方便、省工安全和理化性质稳定等优势，能满足植物生长时期所需养分，减少了施肥次数以及施肥过程中不必要的成本消耗[2]。缓释尿素可以提高土壤中碱解氮及植株氮的含量，对光合速率、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度也均有提升作用[3]。适宜的施肥量能有效增强文冠果的光合能力，推迟叶绿素的降解时间，并能保持较长的高光合持续期，进而促进新生枝条的生长[4]。研究表明，氮、磷、钾对胡椒抽穗、花穗脱落、叶绿素含量、植株干重都有较大的影响[5]。所以，施肥可以通过调控叶片光合作用、糖类物质含量影响植物生殖生长。但是，目前施肥是如何调控叶片糖类物质含量来影响胡椒果实灌浆的机制尚不清楚。灌浆期是利用光能的关键时期，研究表明灌浆期胡椒利用光能对产量的贡献率为52%[6]，淀粉是胡椒果实的主要组成部分[7]，占胡椒果实质量的50%以上[8]，所以果实灌浆充实的过程主要是胚乳细胞中淀粉生物合成与累积的过程。植物进入生殖生长时期，叶片过渡型淀粉被重新活化，源淀粉储备的改变会影响生殖发育[9]，源库淀粉含量的改变可能被代谢过程关键酶调控。叶片中影响淀粉合成的关键酶焦磷酸化酶(EC 2.7.7.27,AGPase)，影响叶片和果实淀粉降解的关键酶分别为β-淀粉酶(EC 3.2.1.2，BMY)和分支酶(EC 2.4.1.18,SBE)，缓释肥是否通过影响源叶光合作用、源库淀粉代谢过程关键酶，进而影响淀粉在果实累积还需要进一步研究。在胡椒生殖生长时期，研究并探明调控源库淀粉代谢关键酶活性对促进淀粉在源端降解和库端累积，进而提升果实千粒重具有重要意义。本研究通过适量施肥和使用缓释肥相结合，应对胡椒产业供需矛盾突出、促果方法不合理等问题，研究科学施肥促果机理和技术，为生产中采用适当的技术措施促果、节约劳动成本、减轻椒农的压力，提高肥料利用率，获取高产胡椒提供实用的理论和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

以中国热带农业科学院香料饮料研究所的琼海大路胡椒试验示范基地(19°26′N，110°28′E)内的投产1年的热引1号(PipernigrumL.cv.Reyin No.1)胡椒为试材。其中叶片光合生理、碳代谢相关参数选取植株阳面中部枝条，花穗所在叶位下一叶位的完全稳定叶，即倒二叶为试材[10]。该区域年均温24 ℃，日照时数2 155 h，年均降水量约2 072 mm。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 根据2.5 kg目标产量需肥量设计缓释肥(以色列化工集团提供)施用试验，缓释肥在一个作物周期内施用2次，第1次在主花期前施用(8月)，第2次在灌浆期前施用(2月)，设置3种缓释肥施用量(T1=1/2需肥量，T2=1需肥量，T3=3/2需肥量)，其中，氮肥为缓释尿素，磷肥为过磷酸钙，钾肥为缓释KCl肥，2次施肥的同时施有机肥(牛粪)15 kg。以传统施4次速效肥为对照(CK)(表1)，胡椒主花期前(8月)，主花期间(9月和11月各施1次)，灌浆期前(2月)施用，氮肥为尿素和复合肥(N 15%,P2O515%,K2O 15%)，磷肥为过磷酸钙，钾肥为硫酸钾肥，其中主花期前和灌浆期前各施有机肥(牛粪)15 kg。按照表1的方法进行化学肥料施用。每个处理选取6 株长势基本一致的植株，每株作为一个重复。种植园胡椒株行距为 2 m×2.5 m，植株高约1.5 m，冠幅约1.4 m，东西走向。

表1 不同施肥处理Table 1 Different fertilization treatments g·株-1

1.2.2 果实性状和产量测定 在灌浆期施肥处理40 d后，每个处理取一定量的灌浆期果实，统计果穗长度、粒径、千粒重(LA-S千粒重仪)及稔实率。在果实成熟期，把果实分批次采回后置于烘箱，55 ℃烘干至质量恒定，称重统计产量。

1.2.3 光合参数测定 在灌浆期施肥处理30 d后，采用便携式光合仪(LI-6400,LI-COR,Lincoln,NE,USA)测定倒二叶 9:00—11:30 时的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间二氧化碳浓度(Ci)。

1.2.4 样品采集 灌浆期施肥处理40 d上午9:00—11:30，采集胡椒植株阳面中部枝条倒二叶，每株选取10片，同时，采集一定量的果实，叶片和果实分别用锡纸包裹，置于冰盒内，带回实验室浸入液氮中固定20 min左右，放入-80 ℃超低温冰箱中保存待测淀粉和相关酶活性。

1.2.5 碳水化合物含量和相关酶活性测定 称取 0.1g叶片或果实样本于研钵加液氮磨碎，其中叶片选取中间部分[11]，果实将弱势粒和强势粒分开测定，选用苏州科铭生物技术有限公司生产的测试盒测定蔗糖[12]、淀粉[13]、AGPase[14]、β-淀粉酶[15]和淀粉分支酶[16]。

1.2.6 数据统计分析 文中数据使用SPSS Statistic 25.0软件进行方差分析和多重比较。通过数据分析检测不同施肥处理对胡椒产量、果实副性状、叶片光合作用、淀粉含量和代谢酶活性的影响是否存在显著差异。采用GraphPad Prism 8.0.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 缓释肥处理对胡椒产量和千粒重的影响

根据作物需肥量设置的缓释肥处理(T1和T2)，氮磷钾用量比传统4次施肥的用量分别降低17%～58%，58%～79%和33%～66%，但是T1和T2却没有降低胡椒产量，而且T2处理相对于CK还增加了13%，但是，在T3高施肥量的情况下，产量反而有所下降(图1A)，所以，按需施肥，可以在不减产的情况下，减少投入和浪费。施用缓释肥，在按照需肥量的1/2施用时，产量没有降低，所以，又分析了影响产量的关键指标胡椒果实千粒重，研究发现，减量施肥的缓释配方肥处理(T1和T2)没有降低胡椒的千粒重(图1B)，影响胡椒千粒重的关键时期为灌浆期，接下来需要分析该时期影响果实灌浆的关键参数。

2.2 缓释肥处理对胡椒源叶光合作用的影响

灌浆期胡椒叶片光合作用的提升对产量有显著贡献[6]。本研究发现：施用缓释肥，可以有效增加叶片光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)，其中，T1、T2、T3处理相对于CK分别使Pn提高了35%、16%和18%(图2A)，这就有利于胡椒叶片合成光合产物的量增加，增加胡椒生长所需碳源供应量；T2处理相对于CK使Gs显著提升了43%；T1、T2、T3处理相对于CK分别使Tr显著增加了59%、48%和58%，Gs和Tr的提升，有利于增加胡椒地上部对碳源的获取量和根系对养分的吸收量。所以，施用缓释肥的T1、T2和T3处理有利于提升胡椒叶片光合能力，奠定了胡椒生长发育的能量基础。

2.3 缓释肥处理对胡椒源库蔗糖含量的影响

糖类物质在植物灌浆中扮演着重要角色，胡椒是淀粉型种子[7]，淀粉含量占胡椒果实干质量的50%以上[11]，所以，果实灌浆充实的过程主要是胚乳细胞中蔗糖含量逐渐降低，淀粉生物合成与累积逐渐增加的过程，研究蔗糖和淀粉在源库的积累对探明胡椒果实灌浆机理尤为重要。首先，研究不同施肥处理对胡椒源库蔗糖含量的影响，发现施用缓释肥没有显著影响胡椒叶片蔗糖含量(图3A)，但是，可以增加强势粒蔗糖含量，其中T2处理相对于CK增加了36.58%，T3处理相对于CK增加了50.93%(图3B)；缓释肥处理降低了弱势粒蔗糖含量，T1、T2、T3分别降低了13.35%、8.69%和17.12%(图3C)。所以，在胡椒灌浆期，缓释肥处理对源器官蔗糖含量无显著影响，但是，按需施肥的T2和T3处理下强势粒中的盈余的蔗糖较多，CK处理下弱势粒中有较多蔗糖盈余。其次，研究不同施肥处理对胡椒果实淀粉的影响，由图3D可知，T1、T2、T3处理显著降低了灌浆期胡椒源叶淀粉含量，其中T1处理相对于CK降低了23.72%，T2处理相对于CK降低了22%；对果实中淀粉累积量分析发现T1、T2、T3处理可以提高强势粒淀粉含量，但是不显著(图3E)，分析弱势粒淀粉含量，发现相对于传统施肥处理CK，T1处理显著提高了弱势粒果实淀粉含量达78.38%，T2显著提高了72%(图3F)，所以，缓释肥处理(T1、T2、T3)可以降低叶片淀粉含量，减少的淀粉有可能转为蔗糖供给果实发育，对果实的研究发现缓释肥处理确实增加了果实淀粉累积，但是对强势粒的增加不显著，主要表现为对弱势粒的增加。

注：柱状图上方n.s.代表不同处理间无显著差异(P=0.05)。下同。Note:n.s.indicate no significant differences according to the ANOVA in SAS (P=0.05).The same as below.图1 不同施肥处理的胡椒产量Fig.1 Pepper yield under different fertilization treatments

注：柱状图上方小写字母代表不同处理间差异显著(P=0.05)，n.s.代表不同处理间无显著差异。下同。Note:Lowercase letters at the top of bar graph indicate significant differences according to the ANOVA in SAS (P=0.05).The same as blow.图2 不同施肥处理的胡椒源叶光合作用Fig.2 Photosynthesis of pepper leaves treated with different fertilization treatments

图3 缓释肥处理的胡椒源库蔗糖和淀粉含量Fig.3 Sucrose and starch content of pepper leaves and grains treated with slow-release fertilizer

2.4 缓释肥处理对胡椒灌浆期果实性状的影响

灌浆期影响产量的关键果实性状为果穗长、稔实率、粒径和千粒重，研究发现，施用缓释肥的3个处理(T1、T2和T3)都增加了胡椒果穗长和稔实率，但不显著，施用缓释肥的T1和T2处理可以有效增加胡椒果实弱势粒粒径和千粒重，其中T1处理胡椒弱势粒粒径相对于CK增加了22%，千粒重相对于CK增加了40%(表2)，所以，按需或减量施用缓释肥，可以促进胡椒灌浆期弱势粒粒径和千粒重的增加，这是挖掘胡椒产量潜力，在减肥的情况下实现不减产的关键。胡椒弱势粒粒径和千粒重的增加离不开叶片光合作用的增加，以及其向库端果实的分配，接下来还需要研究不同施肥处理对胡椒光合作用和光合产物积累分配的影响。

表2 不同施肥处理的胡椒灌浆期果实性状Table 2 Pepper grain characters in fruit filling stage under different fertilization treatments

2.5 灌浆期源叶和果实糖类物质含量与果实性状的相关关系

灌浆期源叶蔗糖含量与强势粒和弱势粒的粒径、千粒重无显著相关关系，库器官强势粒的蔗糖含量与强势粒果实粒径和千粒重相关性不显著，弱势粒的蔗糖含量与弱势粒的粒径显著负相关，与弱势粒千粒重无显著相关关系。源叶淀粉含量与强势粒粒径无显著相关性，与弱势粒粒径显著负相关，源叶淀粉含量与强弱势千粒重无显著相关关系，强势粒淀粉含量与果实粒径、千粒重正相关但不显著，弱势粒淀粉含量与果实粒径和千粒重都呈显著正相关关系(表3)。所以，源库蔗糖和淀粉含量对强势粒果实性状影响较小，对弱势粒的粒径和千粒重有显著影响，调控源中糖类物质更少的向淀粉分配，库中更多向淀粉分配，有利于增加果实粒径和千粒重，糖类物质分配对于产量潜力挖掘具有重要意义。

表3 灌浆期源叶和果实糖类物质含量与果实性状的相关分析Table 3 Correlation analysis between the sugar content of the source leaves and the fruit characters during the filling period

2.6 缓释肥处理对胡椒源库淀粉代谢酶活性的影响

为了更有效地调控源库器官糖类物质向淀粉的分配，接下来研究了源库器官中影响淀粉合成和降解的关键酶活性。源库器官中促进淀粉合成的关键酶为AGPase，研究发现几种施肥处理对叶片中AGPase活性影响没有显著差异(图4A)，AGPase活性与源器官叶片淀粉含量呈正相关关系(r=0.45)，所以，适度降低AGPase活性可以降低源叶糖类向淀粉分配。源器官叶片中影响淀粉降解的关键酶为β-淀粉酶，在施用缓释肥后叶片β-淀粉酶活性略有增加(图4D)，分析叶片β-淀粉酶和淀粉含量相关性，发现二者为负相关关系(r=-0.90)，所以，增加源叶β-淀粉酶活性，可以降低源器官淀粉含量。研究不同施肥处理对库器官淀粉合成酶AGPase活性的影响，发现CK和T2处理会降低果实AGPase活性(图4b,c)，分析果实AGPase活性和淀粉含量相关性，强势粒中二者相关关系较小(r=0.15)，弱势粒中AGPase活性和淀粉含量相关性较大(r=0.46)，所以，增加果实AGPase活性，可以提升果实淀粉含量。研究果实中促进淀粉降解的酶淀粉分支酶活性，发现CK和T2处理降低了淀粉分支酶活性(图4E,F)，但是分析淀粉分支酶活性和淀粉含量相关关系，发现无论是强势粒还是弱势粒，二者均呈正相关关系，可能由于胡椒果实淀粉主要为支链淀粉，所以增加果实淀粉分支酶活性也有利于增加胡椒果实淀粉含量。研究还发现叶片中β-淀粉酶活性提升不仅可以降低源叶淀粉含量(r=-0.90)，还有利于增加强势粒(r=0.83)和弱势粒(r=0.80)淀粉含量，所以，β-淀粉酶活性增加对于源库淀粉含量的调控具有重要意义。

图4 不同缓释肥处理的胡椒源库AGPase活性Fig.4 AGPase activity of pepper source library treated with different slow release fertilizers

3 结论与讨论

增产是推动胡椒产业发展的关键。研究发现，施用缓释肥相对于传统施肥，在降低施肥量的情况下千粒重没有减少，所以，施用缓释肥是可以促进胡椒果实灌浆的，但是，促进果实灌浆的机制尚不清楚。本研究通过施用不同含量的缓释配方肥，与传统施肥进行对比，研究缓释配方肥对胡椒光合作用、源库淀粉含量、果实粒径、千粒重和产量的影响，以此来探寻缓释配方肥促进胡椒灌浆的机理。本研究采用缓释配方肥施肥2次，传统施肥需要4次，这就使得省工50%，而施用缓释配方肥相对于传统施肥，氮磷钾肥用量节省17%以上时并没有显著降低胡椒产量和千粒重。所以，本研究重点关注影响胡椒千粒重的关键时期灌浆期，研究该时期碳水化合物在源端的形成和积累以及向库端的分配情况。

首先，叶片的光合作用是影响光合产物总量的关键，研究发现施用缓释配方肥可以有效增加胡椒源叶的光合速率、蒸腾速率和气孔导度，其中光合速率增加有利于叶片光合产物总量增加，蒸腾速率增加还有利于养分吸收量增加，而施适量的氮肥有利于促进植物净光合速率、营养生长和生殖生长。磷直接参与光合作用中二氧化碳的固定和糖类的形成，为植物所需养料的主动吸收提供所需的能量。磷又是作物体内许多代谢过程中的重要催化剂，能加强碳水化合物的合成与运转，有利于糖、淀粉的形成和累积[17]。钾可促进植物的光合作用，提高植物对氮的吸收和利用能力，提高作物中蛋白质、碳水化合物的数量和质量[18]。同时，钾还可以促进碳水化合物和氮的代谢以及光合产物的运输，有利于花芽分化和果实灌浆，进而影响果实重量和品质。所以，施用缓释配方肥促进胡椒源端叶片光合作用的提升对于库端果实灌浆具有重要意义。

其次，淀粉是胡椒果实的主要组成部分[7]，占胡椒果实质量的50%以上[8]，所以，研究灌浆期果实千粒重的增加，主要是研究淀粉在果实中的累积。植物果实发育过程主要是光合产物在源叶的形成累积以及向果实发育的库器官的转运的过程[19]。当光合速率超过叶片输出或储存蔗糖的能力时，就会合成淀粉[20]。施用缓释配方肥，显著提高了胡椒叶片光合能力，光合产物总量会增加，但是，测定叶片蔗糖含量并没有显著增加，那么，蔗糖可能输出至库器官，或者以淀粉的形式储存于叶片，测定叶片淀粉含量发现缓释配方肥处理没有显著增加胡椒叶片淀粉含量，因此，缓释配方肥处理增加的蔗糖主要输出至库器官，测定库器官果实蔗糖和淀粉含量，发现输出至库器官的糖类物质，在缓释配方肥的作用下，主要以淀粉形式储存在胡椒果实中，其中，对于弱势粒淀粉含量的增加有显著促进作用，果实淀粉含量显著促进果实千粒重增加，所以，这就是缓释配方肥处理下，胡椒果实千粒重增加的主要原因。对于碳水化合物输出至库器官，已有研究证明磷钾养分都有促进作用[17-18]，缓释配方肥的氮磷钾按需配比适量施用，对胡椒生长有促进作用，提升了叶片光合作用，其中蒸腾速率的提升，有促进胡椒对养分的吸收，这个良性循环，促使碳水化合物很好的输出至库器官；对于蔗糖运送至库器官，并转化为淀粉储存于其中，起关键作用的可能是淀粉代谢相关酶。

再次，分析淀粉合成和降解相关酶在源库器官的活性，发现，施用缓释配方肥对源叶淀粉合成酶(AGPase)活性提升没有促进作用，此酶是叶片淀粉合成的关键限速酶[21]，但是，可以促进淀粉降解酶(β-淀粉酶)活性提升，这就使得淀粉不会过多的积累于叶片，而是以蔗糖形式运输至库器官，所以β-淀粉酶是可以调控源叶蔗糖和淀粉比例的。在库器官，施用缓释配方肥可以促进果实中AGPase活性的提升，特别是弱势粒中的AGPase活性可以被显著提升，施用缓释配方肥对果实中淀粉降解酶(淀粉分支酶)活性没有显著影响，所以，在库器官中AGPase对调控碳水化合物在蔗糖和淀粉间的分配贡献较大。相关分析结果表明，源器官的β-淀粉酶活性的提升对库器官淀粉含量的增加有较大促进作用。在C3植物中，夜晚淀粉降解为水解途径，β-淀粉酶参与其中起主要作用，白天淀粉降解为磷酸解途径，α-淀粉酶是该途径关键酶，而在CAM植物中，白天和夜晚淀粉降解途径与C3植物相反[22]，那么，在胡椒中β-淀粉酶主要参与哪种途径完成对淀粉的降解，还需要进一步分析。

综上所述，本研究施用缓释配方肥，在氮磷钾肥用量节省17%以上时并没有显著降低胡椒产量和千粒重，主要生理机制为：(1)施用缓释配方肥促进胡椒源端叶片光合作用的提升对于库端果实灌浆具有重要意义；(2)缓释配方肥的氮磷钾按需配比适量施用，对胡椒生长有促进作用，提升了叶片蒸腾速率，促使碳水化合物很好的输出至库器官；对于蔗糖运送至库器官，并转化为淀粉储存于其中，提升果实千粒重起主要作用；(3)提高源叶淀粉降解酶活性和库器官果实淀粉合成酶活性是影响碳水化合物由源至库，并以淀粉形式储存于库中，从而增加产量的关键生理过程。