甘草次酸修饰多西紫杉醇磁性纳米粒的制备与表征

王莎莎 陈家琦 王华华 黄胜楠 贾永艳 祝侠丽

摘 要 目的：制备甘草次酸修饰多西紫杉醇磁性纳米粒（GA-DTX-NGO/IONP-NPs），并对其理化性质进行评价。方法：以磁性纳米氧化石墨烯（NGO/IONP）作为抗肿瘤药物载体，多西紫杉醇（DTX）为模型药物，甘草次酸（GA）为靶头分子。采用水热法合成NGO/IONP、酰胺化反应合成GA修饰的壳聚糖（GA-CS）后，采用傅里葉红外光谱法、差示扫描量热法及振动样品磁测量法等对两者进行表征。采用离子凝胶化法制备GA-DTX-NGO/IONP-NPs;采用透射电镜、纳米粒度分析仪等对其微观形态、粒径及Zeta电位进行观察和测定;采用超滤离心法测定其包封率和载药量;通过观察有无外加磁场时的状态考察其磁性;结合808 nm激光对其进行光热转换试验。结果：成功合成了NGO/IONP和GA-CS，且NGO/IONP呈现超顺磁性。GA-DTX-NGO/IONP-NPs在透射电镜下呈圆球状，粒径为（262.8±4.23） nm，Zeta电位为（13.6±1.51） mV，包封率为（94.29±0.50）%，载药量为（17.12±0.12）%。GA-DTX-NGO/IONP-NPs的外观呈黑色，分散均匀;其在外加磁场下磁性纳米粒可定向移动，显示出良好的磁定向性。在808 nm激光照射下，GA-DTX-NGO/IONP-NPs具有良好的光热转换效应，且呈浓度和时间依赖趋势。结论：本研究成功制备了一种磁性纳米载药系统GA-DTX-NGO/IONP-NPs，可为肿瘤的磁热-化疗联合治疗提供一定的理论依据。

关键词 磁性纳米氧化石墨烯;甘草次酸;多西紫杉醇;磁性纳米粒

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Glycyrrhetinic acid-modified docetaxel magnetic nanoparticles （GA-DTX-NGO/IONP- NPs）， and to evaluate its physicochemical properties. METHODS： Magnetic nano graphene oxide （NGO/IONP） was chosen as the anti-tumor drug carrier， docetaxel （DTX） as the model drug and glycyrrhetinic acid （GA） as the target molecule. Firstly， NGO/IONP was synthesized by hydrothermal method and GA-CS was synthesized by amidation reaction. Fourier IR spectrometer， DSC and vibration sample magnetic measuring instrument were used to characterize NGO/IONP and GA-CS. GA-DTX-NGO/IONP-NPs were prepared by the ion gelation method. TEM and particle size analyzer were used to observe and determine the morphology， particle size and Zeta potential of GA-DTX-NGO/IONP-NPs; the ultrafiltration-centrifugation method was used to determine encapsulation efficiency and drug loading amount; the magnetic properties were investigated by investigating the state with or without external magnetic field; the photothermal conversion test was carried out with laser irradiation of 808 nm. RESULTS： NGO/IONP and GA-CS were successfully synthesized， and NGO/IONP exhibited superparamagnetism characteristics. GA-DTX-NGO/IONP-NPs were spherical under TEM， the particle size was （262.8±4.23） nm and the Zeta potential was （13.6±1.51） mV. The encapsulation rate and drug loading amount were （94.29±0.50）% and （17.12±0.12）%， respectively. GA-DTX-NGO/IONP-NPs were black in appearance and evenly dispersed. Under the external magnetic field， the magnetic nanoparticles could move directionally， showing good magnetic properties. GA-DTX-NGO/IONP-NPs showed a good concentration- and time-dependent photothermal conversion effect under 808 nm laser irradiation. CONCLUSIONS： GA-DTX-NGO/IONP-NPs are successfully prepared. This study could provide some theoretical basis for the combined treatment of magnetic heating-chemotherapy for liver tumors.

KEYWORDS Magnetic nano graphene oxide; Glycyrrhetinic acid; Docetaxel; Magnetic nanoparticles

肝癌是危害人类健康的重大疾病之一 [1-2]。近年来，一种通过磁性纳米粒子（Magnetic nanoparticles，MNPS）發挥作用的磁热疗法（Magnetic hyperthermia therapy，MHT）受到众多研究学者的关注[3]。MHT通过磁滞机制或交变磁场可以诱导MNPS 在肿瘤病灶部位产热，使局部升温至42～46 ℃，但不损伤周围正常组织[4-5]。纳米氧化石墨烯（Nano graphene oxide，NGO）因独特的二维平面结构使其具有载药量高、生物相容性好及稳定性强的优点[6-7]。在各种功能化的NGO中，经过磁性材料修饰后的NGO即磁性纳米氧化石墨烯（NGO/IONP）已作为磁热疗法的药物载体受到了相应研究[8-9]。

多西紫杉醇（Docetaxel，DTX）属于紫杉烷类抗肿瘤药物，具有较为广泛的抗瘤作用，但其本身水溶性差、毒性大、缺乏肿瘤靶向性[10-11]。甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）是传统中药甘草中天然产物甘草酸的三萜苷元成分[12-13]。研究发现，GA具有良好的肝靶向性[14]。鉴于此，本研究以DTX为模型药物，GA修饰的壳聚糖（GA-CS）为主要载体材料，采用离子凝胶化法制备一种同时包裹NGO/IONP、DTX的磁性纳米粒（GA-DTX- NGO/IONP-NPs），并对其进行表征，为肝肿瘤的磁热-化疗联合治疗提供参考。

1 材料

1.1 仪器

METTLERAE240型十万分之一天平、DSC 1 STARE型差式扫描量热（DSC）仪（德国Mettler-Toledo公司）;Nano-ZS90型电位及粒度分析仪（英国Malvern公司）;FD-1A-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）;Spectrum 100型傅里叶变换红外光谱（IR）仪（美国Perkin Elmer公司）;JEM-1400型透射电镜（日本JEOL公司）;22331 Hamburg小型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）;COS-30 A型真空干燥箱（上海施都凯仪器设备有限公司）;T6型新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;DYNACOOL型振动样品磁测量仪（美国Quantum Design公司）;MW-GX-808/3000 mW型激光器（中国科学院长春激光所）;KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

GA原料药（武汉远成共创科技有限公司，批号：405310，纯度：>98%）;DTX原料药（上海瀚香生物科技有限公司，批号：C338774，纯度：>98%）;纳米氧化石墨烯（南京吉仓纳米科技有限公司，批号：JC181213）;N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、CS（上海瑞永生物科技有限公司，批号：RT19U311、RA2017L712）;N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、三聚磷酸钠（天津市致远化学试剂有限公司，批号：2010082022、2017112022）;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，上海思域化工科技有限公司，批号：HF1160624）;甲醇、丙酮等其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 NGO/IONP及GA-CS的合成

2.1.1 NGO/IONP的合成 采用水热法进行合成。称取NGO 20 mg，加入乙二醇-二乙二醇（1 ∶ 19，V/V）混合溶液20 mL，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min，再以探头超声（功率：80 W，频率：20 kHz）5 min。依次称取醋酸钠0.3 g、FeCl3·6H2O 0.108 g加入上述溶液中，搅拌溶解混匀，必要时超声（条件同上），然后放置于200 ℃油浴中搅拌反应10 h[15]。反应结束后，以5 000    r/min离心处理10 min，沉淀用无水乙醇和水多次洗涤后，冷冻干燥即得黑色固体NGO/IONP，以此为抗肿瘤药物载体。

2.1.2 GA-CS的合成 采用酰胺反应合成GA-CS。称取CS 50 mg，溶于1%醋酸溶液10 mL中，4 ℃下放置过夜，使其溶解完全。称取GA 12.5 mg溶于DMF 5 mL中，加入NHS 4.59 mg、EDC·HCl 7.65 mg后冰浴30 min，冰浴结束后将此溶液缓慢滴加到CS溶液中，室温下反应6 h，然后在80 ℃下反应48 h[16]。反应结束后，加入过量（50 mL）丙酮，沉淀6 h以纯化除杂，以3 000 r/min离心5 min后弃去上清，沉淀依次用乙醇、乙醚洗涤后，真空干燥即得淡黄色固体GA-CS。

2.2 NGO/IONP及GA-CS的表征

2.2.1 IR表征 分别将NGO、NGO/IONP以及CS、GA、GA-CS与溴化钾混合后（1 ∶ 100，m/m），压片，采用IR法对上述物质结构进行表征，结果见图1、图2。

由图1可见，与NGO的IR谱图相比，NGO/IONP除了具有NGO的特征峰外，在575 cm-1处出现了Fe—O伸缩峰，提示NGO/IONP成功合成。

由图2可见，在CS的IR谱图中，2 878 cm-1处出现ν（CH2基）伸缩振动吸收峰，1 655 cm-1处出现的弱吸收峰为未完全脱乙酰度ν（NHCOCH3）的酰胺吸收峰，1 596 cm-1处出现的为ν（NH2基）弯曲振动吸收峰。在GA的IR谱图中，2 947 cm-1处出现的为ν（CH2基）伸缩振动吸收峰。在GA-CS 的IR谱图中，出现在GA图谱中2 934 cm-1和CS图谱中2 881 cm-1处出现的ν（CH2基）伸缩振动吸收峰，1 662 cm-1处酰胺ν（C=O）峰明显增强，1 563 cm-1处的ν（NH2基）振动吸收峰减弱，并和酰胺（Ⅱ）峰相重叠成一个较宽的峰，提示GA-CS成功合成。

2.2.2 DSC表征 对CS、GA、GA-CS以及GA-CS物理混合物（质量比为1 ∶ 1）进行DSC扫描，扫描温度为30～400 ℃，结果见图3。

由图3可知，CS与GA有各自不同的吸热峰与放热峰，GA-CS物理混合物中具有二者共同的特征峰。而GA-CS与GA-CS物理混合物的峰形完全不同，与CS相比也有所改变，这证明GA-CS成功合成。

2.2.3 磁性表征 称取NGO/IONP 10 mg，加5 mL水超声，得到NGO/IONP水分散液。在室温条件下，于振动样品磁测量仪中测定该水分散液的磁滞回线，外加磁场区间为-20 000～20 000 Oe，结果见图4。

由图4可知，NGO/IONP的磁化强度随外加磁场的变化而变化，呈现超顺磁性，几乎无磁滞现象，饱和磁化强度大约为22 emu/g。参考前期本课题组建立的IONP的磁滞回线[17]可知，本研究合成的NGO/IONP具有超顺磁性。

2.3 GA-DTX-NGO/IONP-NPs的制备

采用离子凝胶化法[18]制备GA-DTX-NGO/IONP- NPs。称取GA-CS 10 mg，溶于1%醋酸溶液（pH 4.5）5 mL中，搅拌溶解后得GA-CS的高分子溶液。称取NGO/IONP 3 mg，分散于GA-CS溶液中，超声处理30 min，探头超声（功率：80 W，频率：20 kHz）5 min，制得溶液①。稱取DTX 3 mg，溶于0.2 mL甲醇中，将DTX药液加入上述溶液①中，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）2 h，制得溶液②。然后在室温下搅拌的同时，将TPP水溶液（1 mg/mL）缓慢滴加入溶液②中，直至产生淡蓝色乳光时停止滴加，继续搅拌1 h，即得GA-DTX-NGO/IONP-NPs。同法制备空白纳米粒（仅不加DTX，其余步骤相同）。

2.4 GA-DTX-NGO/IONP-NPs中DTX的含量测定

采用紫外-可见分光光度法测定GA-DTX-NGO/IONP-NPs中DTX的含量。

2.4.1 检测波长的确定 称取DTX 2.01 mg，加甲醇溶解并定容至2 mL，得质量浓度为1.005 mg/mL的DTX贮备液;取上述贮备液适量，加甲醇稀释，制成质量浓度为20.1 μg/mL的DTX供试品溶液。取空白纳米粒适量，加甲醇稀释，得空白纳米粒供试品溶液。以甲醇为空白对照进行调零，分别取上述2种供试品溶液于200～500 nm波长范围内进行全波长扫描，结果见图5。

由图5可知，DTX的最大吸收波长为230 nm，空白纳米粒在此波长处基本无吸收，表明空白辅料对DTX测定无干扰，故选择检测波长为230 nm。

2.4.2 方法学考察 （1）线性关系考察：精密吸取“2.4.1”项下DTX贮备液适量，加甲醇分别稀释制成质量浓度为5.02、10.05、15.07、30.15、40.2 μg/mL的对照品溶液，并于230 nm波长处测定其吸光度。以DTX质量浓度为横坐标（x，μg/mL）、吸光度为纵坐标（y）进行线性回归，得DTX的回归方程为y=0.025x-0.043 2（R2=0.999 1）。结果表明，DTX在5.02～40.2 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。（2）其他方法学考察：按照2015年版《中国药典》（四部）[19]标准进行精密度、稳定性和加样回收率考察。结果，精密度、稳定性（0、2、4、6、8、12 h）、重复性试验的RSD分别为0.81%（n=6）、1.04%（n=6）、0.62%（n=6）;低、中、高（6、20、40 μg/mL）3个质量浓度的平均加样回收率分别为99.67%、99.90%、99.89%，RSD分别为0.16%、0.09%、0.04%（n=3）。

2.5 GA-DTX-NGO/IONP-NPs的表征

2.5.1 形态观察 采用透射电镜法进行观察。吸取“2.3”项下空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs 2.5 mL，分别加水定容至5 mL，混匀后，滴至专用的碳膜铜网上，采用磷钨酸染色，待干燥后于透射电镜下观察其形态，结果见图6。

由图6可见，空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs的形态良好，粒径均约为200 nm。与空白纳米粒相比，GA-DTX-NGO/IONP-NPs呈圆球状，有黑色簇状物吸附在纳米粒内外，笔者推测这可能是由于纳米粒负载了大量DTX-NGO/IONP。

2.5.2 粒径及Zeta电位测定 精密吸取“2.3”项下空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs各0.5 mL，分别加水定容至5 mL，混匀后，采用电位及粒度分析仪测定其粒径及Zeta电位的分布，结果见图7、图8。

结果显示，空白纳米粒的粒径为（226.0±3.6） nm，Zeta电位为（15.1±1.0） mV;GA-DTX-NGO/IONP-NPs的粒径为（262.8±4.2） nm，Zeta电位为（13.6±1.5） mV。由图7、图8可见，空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs的粒径和电位分布均较均匀。

2.5.3 包封率及载药量测定 采用超滤离心法[20]测定GA-DTX-NGO/IONP-NPs的包封率和载药量。精密吸取“2.3”项下GA-DTX-NGO/IONP-NPs 0.2 mL，加适量甲醇破乳0.5 h，然后再用甲醇定容至5 mL，采用紫外-可见分光光度仪于230 nm波长处测定溶液吸光度，按照“2.4.2（1）”项下DTX回归方程计算出溶液中DTX总质量，记为W总。精密吸取“2.3”项下GA-DTX-NGO/IONP- NPs 1 mL，置于超滤管中（分子量30 kDa），以5 000 r/min离心15 min，取上清液0.2 mL，加甲醇破乳0.5 h，再用甲醇定容至5 mL，同法于230 nm波长处测定溶液吸光度，按照“2.4.2（1）”项下DTX回归方程计算出溶液中DTX质量，记为W游。纳米粒混悬液中其他材料的质量根据加入量记为W其他。按公式计算包封率和载药量：包封率（%）= [（W总-W游）/W总]×100%;载药量（%）= [（W总-W游）/（W总+W其他）]×100%。结果，DTX的包封率为（94.29±0.50）%，RSD=0.53%（n=3）;载药量为（17.12±0.12）%，RSD=0.70%（n=3）。

2.5.4 磁性檢测 将GA-DTX-NGO/IONP-NPs置于西林瓶中，旁边放置磁铁，0.5 h后室温下拍照，观察有或者无外加磁场时的状态，结果见图9。

由图9可知，GA-DTX-NGO/IONP-NPs在室温下为均匀黑色分散液，在外加磁场下能够迅速向磁场聚集得到澄清溶液，经振摇后又重新分散均匀。综合“2.2.3”项下结果，表明GA-DTX-NGO/IONP-NPs具有良好的磁定向性。

2.5.5 光热转换试验 参考文献方法[21]进行光热转换试验。精密吸取GA-DTX-NGO/IONP-NPs适量，加水稀释，制成NGO/IONP质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的溶液，并以水为对照组（记为0 mg/mL）。分别取上述溶液各3 mL，置于石英比色皿中，采用激光器（2.5 W/cm2）照射，激发波长为808 nm，每30 s记录1次温度。以时间（min）为横坐标、温度（℃）为纵坐标，采用Origin 2019软件绘制光热转换曲线，结果见图10。

由图10可知，0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL 4 个质量浓度的GA-DTX-NGO/IONP-NPs随着照射时间的延长，其温度均先快速上升，而后趋于平缓;且质量浓度越大，温度上升速度越快。试验过程中对照组温度几乎无变化。结果表明，GA-DTX-NGO/IONP-NPs 具有浓度和时间依赖趋势的光热转换特性。

3 讨论

以CS作为纳米粒的载体材料，不仅安全无毒，且能够大幅提高药物的包封率及载药量，有效改善DTX入血后血药浓度低、生物利用度低等缺点。采用GA靶向修饰CS，利用GA良好的肝靶向性能赋予纳米粒主动靶向性，有望提高药物的肝肿瘤靶向性。

在肿瘤的治疗中，磁热疗法往往要与化疗结合。NGO/IONP作为磁热疗法中采用的常见纳米材料之一，因其独特的理化特性和光学性质，具有缓释性、靶向性及血脑屏障穿透性等优点，多用作肿瘤药物的载体从而进行靶向治疗[22-23]。NGO/IONP纳米尺径的大小会影响药物载体结合后的稳定性、纳米粒的成形甚至靶向定位效果，故对磁性材料尺径的调控至关重要。本研究所合成的NGO/IONP粒径在200 nm左右，对纳米粒的成形基本没有干扰作用。目前，关于NGO/IONP的研究大多只限于细胞试验和动物实验，真正用于临床上的成熟剂型很少，且国际上对其毒性大小也没有一个公认的标准，故NGO/IONP的安全性及稳定性仍需进一步考察改进，以期未来其能在肿瘤的诊断与治疗中发挥更大的作用。

本研究所制备的GA-DTX-NGO/IONP-NPs分散性良好、粒径大小较为均匀、包封率和载药量均较高，在外加磁场下可定向移动，具有良好的光热转换性能，可为将其应用于肝肿瘤磁热-化疗联合治疗提供一定的理论依据。

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（收稿日期：2020-06-23 修回日期：2020-08-13）

（编辑：林 静）