“甘草-马钱子”配伍前后及其拆分相态指纹图谱对比研究
2020-10-30郭玉岩李春成孙爽杨大宇吕邵娃
郭玉岩,李春成,孙爽,杨大宇,吕邵娃
(黑龙江中医药大学药学院,黑龙江 哈尔滨 150040)
中药配伍减毒是中医药学的特色和优势之一,有毒中药通过与其它药物配伍,不仅可以增强药力、提高疗效,同时又可减轻或消除毒副作用。马钱子为典型的有毒中药,其因止痛作用较为明显[1],为历代医家所推崇,与甘草配伍为其常见的减毒方法[2],古籍有记“生马钱子加甘草浸泡”“服马钱子量大时,饮甘草水解之”“马钱子内服方剂与甘草配伍”或“甘草炙马钱子”等,现代含有马钱子的舒筋丸、疏风定痛丸等口服制剂处方也均见与甘草配伍使用,足见甘草能缓和马钱子的毒性。目前已有不少学者关注了甘草配伍马钱子减毒的这一现象,本课题组前期研究发现,甘草和马钱子在水煎煮过程中生成了大量沉淀,推测煎煮过程中溶入水体的次生代谢小分子成分、生物大分子物质以及无机元素等均影响和改变着汤液的理化性质,这些天然的表面活性剂,可起到助悬、絮凝和反絮凝等多种作用,使得汤液成为真溶液、胶体溶液和混悬液及大分子沉淀颗粒同时存在的复杂分散相态;进一步对各相态中的毒效物质含量进行测定发现,沉积物相态富集了近80%的毒效物[3]。然而甘草与马钱子配伍前后是否有化学成分的改变,不同产地、批次药材配伍后化学成分的监控,以及甘草-马钱子配伍拆分相态、化学成分的迥异均仍有待进一步研究。
指纹图谱技术是能够标示中药化学成分特征的经典技术,其既可以对已知成分进行分析,也可以对未知成分进行分析[4],可较为全面地反映混合的复杂体系中各种化学成分及其含量情况[5],为此,本文采用指纹图谱技术,对甘草-马钱子药对配伍前后及其拆分相态的化学成分进行特征分析,以期为甘草马钱子的配伍应用提供检测手段,并为甘草解马钱子之毒的研究提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
UItiMate3000色谱仪(美国Thermo Fisher Scienti-fic公司);AB265-S分析电子天平(美国METTLER-TOLEDO公司);SB-5200D型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2 材料
马钱子、甘草药材购自于北京同仁堂哈尔滨药店有限责任公司;马钱子碱(Y16A7S13272)、士的宁(Z02A7S18869)均购自上海源叶生物科技有限公司;甘草苷(HL04223898)、甘草素(HL042236198)、甘草酸(HI042238196)、异甘草素(HL042236198)、甘草查尔酮A(HL042237198)、甘草次酸(HL042902198)、异甘草苷(HI042234198)、芒柄花素(HL042235198) 均购自宝鸡市晨光科技有限公司,甲醇、乙腈、冰醋酸、浓盐酸、 三乙胺、磷酸等均为分析纯级试剂。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm 5 μm)色谱柱;以乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)为流动相,梯度洗脱(0~10 min,5%~10% A;10~20 min,10%~13% A;20~30 min,13%~15% A;30~40 min,15%~20%A;40~45 min,20%~23%A,45~60 min,23%~32%A,60~80 min,32%~38%A;80~90 min,38%~48%A;90~105 min,48%~65%A;100~115 min,80%A);流速1 mL/min;柱温25 ℃;检测波长254 nm;进样量10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
取士的宁、马钱子碱标准品适量,置10 mL量瓶中,加甲醇超声溶解,定容至刻度,使浓度分别0.205、0.215 mg/mL。另取甘草苷、异甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草查尔酮A、异甘草素、甘草次酸、芒柄花素对照品适量,置10 mL量瓶中,加甲醇超声溶解,定容至刻度,制成浓度分别为0.189、0.198、0.250、0.216、0.202、0.246、0.217 mg/mL的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 甘草、马钱子及甘草-马钱子配伍供试品溶液的制备
分别称取0.75 g甘草,0.25 g马钱子,0.75 g甘草与0.25 g马钱子的混合粉末,分别置于25 mL量瓶中,加盐酸-甲醇-水(1∶50∶50)适量,超声处理45 min,放冷,用盐酸-甲醇-水(1∶50∶50)补足至刻度,摇匀,过滤,取续滤液即分别为甘草、马钱子及二者配伍供试品溶液。
2.3.2 甘草-马钱子配伍相态供试品溶液的制备
按文献进行汤液相态拆分:精密移取马钱子甘草共煎液,采用低温沉降,高速离心以及生物膜透析的方法将汤液拆分成马钱子甘草共煎液沉积物组、混悬物组、胶体液分、溶液组4个相态部分[6]。所有样品真空冷冻干燥24 h,取出备用。
拆分相态供试品溶液的制备:分别取马钱子甘草汤液相态冻干粉约1 g,加盐酸-甲醇-水(1∶50∶50)适量,超声处理45 min,放冷,用盐酸-甲醇-水(1∶50∶50)补足至刻度,摇匀,过滤,取续滤液即得甘草-马钱子相态的供试品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验
取甘草-马钱子配伍供试品,按“2.3”项下的方法制备供试品溶液,按“2.1” 项下的的色谱条件连续进样6次,分别以甘草酸的色谱峰为参照峰(S),测定并计算得到共有峰相对保留时间RSD<2%,表明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性试验
取甘草-马钱子配伍供试品,按“2.3”项下的方法制备供试品溶液,按“2.1” 项下的的色谱条件,分别于0,2,4,6,8,12 h进样测定以甘草酸为参照峰(S),测定并计算得到共有峰相对保留时间RSD<2%,表明稳定性良好。
2.4.3 重复性试验
取甘草-马钱子配伍供试品,按“2.3”项下的方法分别平行制备6份供试品溶液,按“2.1” 项下的的色谱条件进样6次,以甘草酸的色谱峰为参照峰(S),测定并计算得到共有峰相对保留时间RSD<2%,表明重复性良好。
2.5 指纹图谱及相似性评价
按“2.3”项下的方法,分别制备甘草、马钱子,甘草-马钱子配伍供试品溶液及四种相态拆分样品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样测定并记录UPLC 色谱图。将甘草-马钱子配伍供试品溶液色谱图cdf文件导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”中,然后进行谱峰匹配, 通过与对照品比对,共确定25个共有峰。指认出9个成分。结果见图1、图2,表1、表2。通过比较甘草-马钱子配伍供试品溶及混合对照品的图谱,对合煎液中各共有峰进行初步归属,1~5峰归属于马钱子,6~25峰归属于甘草。通过保留时间和 UV 光谱的对照,确定色谱峰4,5,8,11,12,16,18,23,25,分别对应马钱子碱、士的宁、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A、甘草次酸9个指标性成分;分别计算各共有峰的相对保留时间RSD为0.31%~2.80%。不同样品各共有峰的峰面积相差较大,表明不同产地甘草与马钱子的化学成分含量存在一定的差异。配伍后色谱与对照图谱的相似度均在0.900以上,说明样品指纹图谱与对照图谱的相似度较高,符合指纹图谱的要求。
2.6 配伍前后指纹图谱对比分析
通过对马钱子、甘草单煎及其配伍前后指纹图谱对比分析,鉴定结果显示,经过配伍后,经过配伍后,没有新峰出现,没有出现差异峰,而经配伍后士的宁与甘草酸的峰面积显著减少,推测甘草-马钱子配伍后减毒可能因为物理变化,结果见图3。
2.7 不同相态指纹图谱对比分析
以9种指标性成分对马钱子甘草配伍拆分后的四种相态色谱图进行对比分析发现,甘草-马钱子配伍后的活性成分大多数集中在沉积物相态中,在四种相态中,均有4、5、8、11号峰,分别为马钱子碱、士的宁、甘草苷、异甘草苷。均检是马钱子-甘草配伍相态溶液中的特征性成分。其中D相态中包含所有指认峰,A、B相态均有4、5、8、11、16、18,分别为马钱子碱、士的宁、甘草苷、异甘草苷、异甘草素、甘草酸。C相态中指标性成分最少。
注:4.马钱子碱;5.士的宁;8.甘草苷;11.异甘草苷;12.甘草酸;17.甘草素;19.异甘草素;22.甘草查尔酮A;24.甘草次酸。图1 马钱子甘草配伍样品UPLC图谱
图2 马钱子甘草配伍样品UPLC叠加图谱
注:A.马钱子供试品;B.甘草供试品;C.马钱子-甘草配伍供试品。图3 马钱子-甘草配伍前后指纹图谱对比UPLC色谱图
表1 马钱子-甘草配伍样品共有峰的相对保留时间及相似度
表2 马钱子-甘草配伍样品共有峰的相对峰面积
注:A.混悬相态;B.胶体相态;C.溶液相态;D.沉淀相态。图4 马钱子-甘草配伍四种相态的UPLC色谱图
3 讨论
3.1 提取溶剂的选择
考察以水、甲醇-水(1∶1)、盐酸-甲醇-水(1∶50∶50)为溶剂对马钱子、甘草单煎液、马钱子-甘草配伍液的指纹图谱的影响[7]。结果表明,以盐酸-甲醇-水(1∶50∶50)为溶剂,超声提取提取所得的色谱峰信息量相当,综合考虑溶剂提取能力、色谱结果的准确性,确定以盐酸-甲醇-水(1∶50∶50)为超声提取制备供试品。
3.2 流动相的选择
分别考察乙腈-1%乙酸、乙腈-0.2%乙酸-0.2%三乙胺、乙腈-0.2%乙酸、乙腈-甲酸水(pH=2.4)及乙腈-0.1%磷酸水为流动相,并不断调整流动相的比例来确定甘草-马钱子最佳色谱条件[8]。结果以乙腈-0.1%磷酸水为流动相,在选定的条件下,峰信息量较多,各色谱峰的分离效果较好,峰形优良。
3.3 马钱子-甘草指纹图谱的建立
甘草-马钱子是经典的苦甘药对,甘草对马钱子减毒增效作用显著,是临床上常见配伍药对。目前已有金永新等对乌拉尔甘草进行高效液相指纹图谱的研究[9]。王月辉、乔菲等[10-11]等采用HPLC进行了马钱子指纹图谱的研究,建立了指纹图谱,具有重要的现实意义。然而,由于毒性限制,马钱子在临床中很少单独使用,上述研究立足于甘草与马钱子单独的指纹图谱研究,却忽略了甘草与马钱子配伍前后化学成分的变化和复方中各个成分间作用的“复杂性”“整体性”,难以较好诠释两者配伍“毒解而效不减的作用机制。本研究建立马钱子-甘草配伍后的指纹图谱方法,指认了9个共有峰,相似度评价结果显示,该结直观、可靠、可操作性强,可为甘草和马钱子的配伍应用提供质量研究方法。
3.4 马钱子-甘草配伍前后化学成分的改变
中药复方煎煮过程中常伴随一系列复杂的物理、化学反应,通过对关键药对的分析,可深入挖掘中药复方配伍规律,化学成分是药对产生疗效的物质基础,因此可以从药对配伍前后的化学成分变化着手探究配伍基础。由于现阶段多数中药物质基础不明确,指纹图谱可更全面反应药对所含化学成分的种类与数量,可进一步阐明药对配伍增效的物质变化基础,体现了配伍过程中化学成分的整体变化情况。本文在指纹图谱方法的基础上,对马钱子-甘草配伍前后的色谱峰进行对比研究,结果显示与单煎液相比,配伍后的色谱峰个数并没有明显变化,没有新峰出现;然而,配伍样品的色谱峰可见士的宁与甘草酸的峰面积显著降低,且本课题组对配伍汤液进行拆分时发现,其有大量新生沉淀的产生,推测马钱子和甘草合煎过程,可能存在分子络合等物理反应的发生而起到减毒增效的作用。
3.5 马钱子-甘草配伍汤液相态的色谱图对比分析
近年来,以相态角度对有毒中药的研究已取得一定的成果,例如研究发现附子-甘草药对配伍时,其合煎浑浊汤液静置后出现大量沉积物[12],又有研究者发现,部分药对如黄芩-黄连合煎产生的沉淀影响药物效应等[13]。本课题组前期[3]将甘草-马钱子进行了相态拆分,获得溶液相态、胶体相态、混悬相态和沉积物4个相态,并对毒效成分的相态分布进行了研究,本文通过指纹图谱方法对4个相态的成分进行对比分析,结果表明沉积物相态为活性成分的聚集相态,该相态的进一步深入解析,可为马钱子甘草配伍减毒机制提供又一突破。