南川百合种子萌发及组织培养快繁技术研究

张梅 张杰 王强

摘 要：研究不同温度以及不同浓度赤霉素对南川百合种子萌发的影响，并以南川百合的鳞片和叶片作为外植体探究南川百合组培快繁技术，探究无机盐浓度对南川百合外植体分化的影响。结果表明：处理条件为16℃加200mg·L-1赤霉素时南川百合种子萌发率最高，萌发速度也最快，温度对南川百合种子萌发率的影响具有显著性;当用南川百合的鳞片作为外植体时，MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA为最佳诱导分化培养基，无机盐和有机物浓度高鳞片外植体分化率也较高;当用南川百合叶片作为外植体时，MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA为最佳诱导分化培养基，无机盐和有机物浓度越高外植体分化率越低。

关键词：南川百合;种子萌发;组织培养;外植体

中图分类号：S-3       文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930047

南川百合（Lilium rosthornii Diels）为百合科百合属多年生草本植物，是我国特有的原生百合之一，具有较高的园艺观赏价值和一定药用价值。由于南川百合对生长环境的要求比较苛刻，加之人为采挖比较严重，目前野生南川百合种质资源急剧减少甚至在一些分布区已经绝迹[1]，因此对于南川百合的生长繁育进行研究十分有必要。

目前，国内关于南川百合种子萌发特性的报道较少[2，3]，关于南川百合组织培养的研究通常以鳞片为外植体，聚焦于研究激素配比和有机添加物对诱导分化的影响[4-8]。本文通过试验探究温度和赤霉素对南川百合种子萌发的影响，以鳞片和叶片为外植体研究南川百合组培快繁条件，特别研究了无机盐和有机物浓度对南川百合外植体分化的影响，对促进南川百合人工繁育技术有一定参考意义。

1 试验与方法

1.1 试验材料

南川百合引种自湖北宜昌，栽培于阿坝师范学院花卉繁育基地;种子为头年采收种子，选取饱满、大小相近的种子进行实验;鳞片选取饱满无病虫害的鳞片，叶片选取植株较上端的幼嫩无病害叶片。实验中所用无机盐和蔗糖均为AR级，其它有机物和植物生长调节剂为BR级。

1.2 试验方法

1.2.1 温度和GA3对南川百合种子萌发的影响

选取颗粒饱满大小均匀的种子，装入尼龙网袋，用流水冲洗20min，将种子分为5组，分别放置于0mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、150mg·L-1及200mg·L-1的GA3溶液中浸泡6h。浸泡完成后，将种子平铺于无菌蒸馏水润湿的灭菌滤纸上，放到玻璃培养皿中，置于人工气候箱中培养。4台人工气候箱的温度分别设为16℃、19℃、22℃和25℃，湿度为75%，光照强度为2600Lx，光照时长为12h·d-1;每个气候箱都包含5种GA3处理条件的种子，每个条件以20粒种子为1组。每3d观察1次，胚根露出种皮后，每天观察1次，做好数据记录。

1.2.2 鳞片外植体的初代培养

取鳞茎中外层饱满健康鳞片，冲洗净泥土，用含少量洗衣粉溶液浸泡10min，用自来水冲洗20min备用;外植体消毒条件为75%乙醇浸泡30s后，再放入0.1%的升汞溶液浸泡8min，接着用无菌水冲洗5～6次;将消毒后的鳞片切成边长0.5～1cm的方块接种到初代培养基上，初代培养基为MS培养基，蔗糖浓度为40g·L-1，琼脂为8g·L-1，pH为5.6～6.0，以NAA和6-BA为诱导分化激素，设计试验见表1。接种完成后置于培养室培养，培养条件为光照强度1500～2000Lx，光照时间12h·d-1，温度为25±2℃。

1.2.3 无机盐和有机物浓度对鳞片外植体分化的影响

为探究无机盐和有机物浓度对鳞片外植体分化的影响，分别以MS，1/2MS，1/4MS培养基为基础培养基，蔗糖浓度为40g·L-1，琼脂为8g·L-1，以鳞片外植体初代培养实验所确定的具有最佳诱导分化效果的激素配比作为激素处理条件，外植体消毒及接种后的培养条件同上。

1.2.4 叶片外植体的初代培养

取南川百合植株上部幼嫩无病害叶片，在流水下冲洗20min，然后于超净工作台用75%乙醇浸泡8s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞溶液浸泡5min，最后用无菌水清洗5～6次，每次2～3min，将消毒好的叶片放在无菌滤纸上吸干表面的水分，用手术刀切割为大约1cm×1cm的小块接种到培养基上。培养基蔗糖浓度为40g·L-1，琼脂为8g·L-1，激素添加情况如表2所示。每个处理条件接种30块外植体，培养条件同鳞片外植体初代培养。

1.2.5 无机盐和有机物浓度对叶片外植体分化的影响

以MS、1/2MS、1/4MS培养基为基础培养基，蔗糖浓度为40g·L-1，琼脂为8g·L-1，以叶片外植体初代培养实验所确定的具有最佳诱导分化效果的激素配比作为激素处理条件，外植体消毒及接种后的培养条件同叶片外植体的初代培养。

1.2.6 生根培养

生根培养采用赵静确定的培养条件1/2MS加10.0mg·L-1PP333加0.5mg·L-1NAA[5]。

1.2.7 组培苗的移栽炼化

待组培苗长至3～4cm高时，将培养瓶置于室内无阳光直射处炼苗7d，然后拧松瓶盖培养2d，再完全揭去瓶盖于室内静置3d，使组培苗逐渐适应外界环境，最后将组培苗从培养瓶移出，小心洗净根部琼脂，种植于培养基质中，培养基质配比为田园土∶珍珠岩∶蛭石=2∶1∶1。

2 结果与分析

2.1 温度及GA3对南川百合种子萌发的影响

按照前述方法，将GA3处理好的种子置于不同温度人工气候箱中培养，培养35d后统计数据如表3所示。从表3可知，南川百合种子萌发率最高的处理组合为200mg·L-1GA3浸泡6h加16℃恒温培养，在该条件下种子萌发率为70%，开始萌发时间最短，仅为13d。用SPSS25对实验结果做方差分析和多重比较，结果表明，在显著性水平为0.05情况下，GA3处理对南川百合种子萌发没有显著影響，温度对南川百合种子萌发的影响具有显著性，温度的F值为7.378，最适南川百合种子萌发的温度为16℃。

2.2 鳞片外植体的初代培养

南川百合鳞片外植体初代培养30d后统计数据见表4。从表4可知，在MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培养条件下鳞片外植体有最高的分化率为46.67%。

2.3无机盐和有机物浓度对鳞片外植体分化的影响

以MS、1/2MS、1/4MS培养基为基础培养基，每种培养基另外添加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA，诱导南川百合鳞片外植体分化产生不定芽，培养30d后结果如表5所示。从表5可知，MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培养培养条件有最高的分化出芽率，1/4MS加2.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA分化出芽率最低;并且MS培养基上生长的不定芽株形正常、长势更佳、叶片更绿，而1/2MS和1/4MS培养基上生长的不定芽生长更慢，叶片易发黄枯萎（如图1所示）。由此可见，较高的无机盐和有机物浓度有利于南川百合鳞片外植体分化产生不定芽，也有利于不定芽生长发育。

2.4 叶片外植体的初代培养

按前述试验设计接种南川百合叶片外植体，培养30d后观察统计的试验结果见表6。从表6可知，在MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培养条件下，南川百合的叶片外植体有最高的愈伤组织分化率，分化率达60%;当培养基6-BA浓度达2.0mg·L-1时，对南川百合叶片外植体的分化有明显的抑制作用;在不添加外源激素的培养条件下，叶片外植体也基本不分化。将试验数据用SPSS25进行方差分析和多重比较，结果表明，在显著性水平为0.05情况下，6-BA对南川百合叶片外植体的分化具有显著影响，F值为11.139，6-BA浓度为1.0mg·L-1时最有利于叶片外植体的分化，与其它培养条件相比具有显著差异。

2.5 无机盐和有机物浓度对叶片外植体分化的影响

以MS、1/2MS、1/4MS培养基为基础培养基，每种培养基另外添加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA，诱导南川百合叶片外植体分化产生不定芽，培养30d后结果如表7所示。从表7可知，1/4MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培养条件最有利于南川百合叶片外植体分化不定芽，其不定芽分化率为26.67%，而MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培养条件下叶片分化率最低，表现出低浓度的无机盐和有机物水平有利于南川百合叶片外植体的分化，这与鳞片外植体的情况刚好相反。从图2可知，培养30d后在MS培养基上多数叶片外植体已经坏死，有少量外植体分化出小小的芽点。而此时，在1/2MS和1/4MS培养基上的不定芽已经生长到2～4cm高，部分在1/4MS培养基上生长的不定芽已经分化出根。

2.6 组培苗的炼化栽培

以前述方法进行组培苗的炼化移栽，30d后统计成活率，成活率达91.4%。

3 分析与展望

试验表明，较低的温度有利于南川百合种子的萌发，而GA3的处理对南川百合种子的萌发则没有表现出明显的促进作用，南川百合种子萌发不需要黑暗的条件，但黑暗环境和光照环境谁更有利于南川百合种子萌发还有待进一步研究。总体来看，南川百合种子萌发不存在困难，播种繁殖是南川百合一条有效繁殖途径。

和多数野生百合一样，南川百合的鳞片外植体也是比较容易分化的，但有试验表明，南川百合的叶片外植体分化比较困难[5]。通过试验发现，MS加1.0mg·L-16-BA加0.1mg·L-1NAA的培养条件比较有利于南川百合叶片外植体的分化，特别是1.0mg·L-16-BA对南川百合叶片外植体分化有明显的促进作用，但在MS培养基上叶片外植体分化出的多数为愈伤组织，要经过较长时间生长才有少量愈伤组织开始分化不定芽。同时也发现较高浓度的6-BA会明显抑制南川百合叶片外植体的分化，在2.0mg·L-16-BA的培养条件下没有发现一份叶片外植体分化，培养一段时间都枯萎死亡，所以在诱导南川百合叶片外植体分化的实验中，6-BA的浓度是一个关键的因素，但相关机理还有待进一步探索。

在研究无机盐和有机物浓度对南川百合外植体分化的影响时，发现较高浓度的无机盐和有机物（如MS培养基）有利于南川百合鳞片外植体分化产生不定芽，而较低浓度的无机盐和有机物（如1/4MS培养基）有利于南川百合叶片外植体分化产生不定芽。在已有的报道中，百合叶片外植体的分化往往是比较困难的，但是却很少试验1/2MS和1/4MS培养基对叶片分化不定芽的影响，1/2MS和1/4MS培养基通常用于和生根培养有关的试验中。从本文试验来看，较低浓度的无机盐和有机物有利于南川百合叶片分化不定芽，对于其它种类的野生百合是否也存在这样的现象是非常值得进行研究的。

参考文献

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[8]王元忠，沙本才.南川百合的组织培养和快速繁殖（简报）[J].亞热带植物科学，2008，37（03）：69-70.

（责任编辑  周康）