不同产地大果山楂总黄酮含量及抗氧化活性*

孙 博，霍华珍，蔡爱华，谢运昌，李典鹏**

(1.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西桂林 541006)

0 引言

大果山楂为蔷薇科苹果亚科苹果属植物台湾林檎Malusdoumeri(Bois) Chev.和光萼林檎MalusleiocalycaSZ.Huang.的干燥成熟果实，但实际生产中的树种均为台湾林檎[1]。大果山楂主要分布于我国的中部和南部地区[2]，是广西重要的经济作物，具有80多年的栽培史。在政府扶贫项目的扶持下，广西逐步发展成为大果山楂的主产地。据1990年版《广西中药材标准》记载，大果山楂果实性味甘、酸、涩、微温，有理气健脾和消食导滞功效[3]。现代药理研究表明大果山楂具有开胃助消化、降血脂、消炎抗菌及抗肿瘤效果[4]。大果山楂具有果大、气味清香、酸甜适中的特点，是制作山楂糕、山楂片、蜜饯等传统食品的原料[5]，因此大果山楂具有较强的市场生命力，值得进一步开发利用。

黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物，在植物体中主要以糖苷形式存在，具有多种生物活性，在抗氧化、防癌和抑制脂肪酶活性等方面具有明显作用[6]。大果山楂因富含黄酮类物质而具有抗氧化、清除自由基和抗衰老等功效[7-9]。目前对单一产地或品种的大果山楂化学成分和药理作用等方面的研究较多[10]，对不同产地大果山楂果实总黄酮含量及其抗氧化活性的报道较少[7,11-12]。已发表的关于大果山楂总黄酮含量的测定方法主要为高效液相色谱法[7]和可见分光光度法[12]。与高效液相色谱法相比，可见分光光度法具有适用性较广、操作简单、测试时间短、精密度高和准确度较好等特点。因此，本文以10种产地的大果山楂鲜果为研究对象，采用可见分光光度法测定总黄酮含量，并测定其对DPPH自由基的清除能力和氧自由基的吸收能力，以期为大果山楂原料和产品的质量控制，以及功能性食品的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2019年10月采摘来自于广西、广东10种不同地方的成熟大果山楂鲜果，经李典鹏研究员鉴定均为台湾林檎Malusdoumeri(Bois) Chev.果实，各样品编号及产地信息如下：M1，广西天峨县；M2，广西柳江区；M3，广西德保县；M4，广西靖西市；M5，广西长洲区；M6，广西昭平县；M7，广西钟山县；M8，广西平乐县；M9，广西恭城县；M10，广东信宜市。选择没有病虫害、无机械损伤且成熟度基本一致的大果山楂，在4℃条件下贮藏备用。

1.2 试剂

芦丁、水溶性维生素E类似物Trolox(纯度≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司)，亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(分析纯，西陇化工股份有限公司)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(纯度≥97%，福州飞净生物科技有限公司)，2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸(ABAP，分析纯，济南荣正化工有限公司)，荧光素钠(分析纯，西安百萤生物科技有限公司)。试验用水为实验室自制超纯水。

1.3 仪器设备

电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)，T6紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，XS205分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，RIOS 8超纯水系统(美国Millipore公司)，100—1 000 μL Finnpipette F1移液器(美国Thermo Fisher公司)，高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，LHS智能恒温恒湿箱(上海一恒科学仪器有限公司)，HH-S4恒温水浴锅(上海况胜实业发展有限公司)，N1100旋转蒸发仪(上海艾朗仪器有限公司)，超声波清洗机(深圳福洋科技集团有限公司)，Tecan Spark多功能酶标仪(上海帝肯贸易有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 大果山楂总黄酮的提取

参考大果山楂鲜果总黄酮回流提取法[11]和超声提取法[13]，稍作改进，使用两种方法提取大果山楂总黄酮。

回流提取法：以广西天峨县大果山楂为原料，称取10 g鲜果匀浆，在提取溶剂为70%乙醇、提取温度70℃、料液比1∶18 (g/mL)的条件下，回流提取2 h，抽滤，并重复提取3次，滤液合并减压浓缩后用70%乙醇定容至100 mL，平行试验3次。

超声提取法：以广西天峨县大果山楂为原料，称取10 g鲜果匀浆，在提取溶剂为70%乙醇、料液比1∶18 (g/mL)、超声功率300 W的条件下，超声提取40 min，抽滤，重复提取3次，滤液合并减压浓缩后用70%乙醇定容至100 mL，平行试验3次。

1.4.2 溶液的制备

(1)对照品溶液的制备：精密称取5.00 mg芦丁对照品，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，得0.20 mg/mL芦丁对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：随机取各产地大果山楂果实匀浆10 g，在提取溶剂为70%乙醇、料液比1∶18 (g/mL)、超声功率300 W的条件下，超声提取40 min，抽滤，重复提取3次，滤液合并减压浓缩后用70%乙醇定容至100 mL。

1.4.3 可见分光光度法方法学考察

以芦丁为对照品，采用可见分光光度法对大果山楂总黄酮的含量进行测定。

(1)溶液显色方法

参照文献[14]进行。取适量1.4.2节中的待测供试品溶液置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇至10 mL，接着再加入1 mL 5%亚硝酸钠，混匀，放置6 min；然后加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min；再加入10 mL 4%氢氧化钠溶液，最后加入50%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后在510 nm波长处测定吸光度。

(2)线性关系

分别取芦丁标准品溶液0.0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3节步骤(1)进行显色，以相应试剂为空白，在510 nm波长处测定吸光度，以反应体系芦丁含量(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

(3)精密度试验

精密吸取1.4.2节制备的供试品溶液0.3 mL，置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3节步骤(1)进行显色，显色后平行6次测定吸光度。

(4)稳定性试验

精密吸取1.4.2节制备的供试品溶液0.3 mL，置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3节步骤(1)进行显色，显色后于 0，15，30，45，60 min时测定吸光度。

(5)重复性试验

精密称取同一个产地大果山楂果实匀浆6份，按1.4.2节方法进行供试品溶液的制备，取0.3 mL该溶液，置于25 mL容量瓶中，按照1.4.3节步骤(1)进行显色，显色后测定各溶液的吸光度。

(6)大果山楂总黄酮含量测定

精密吸取0.3 mL 1.4.1节提取的总黄酮提取液和1.4.2节制备的供试品溶液，参照1.4.3节步骤(1)进行显色，在510 nm波长处测定吸光度并计算其总黄酮含量，每个样品平行测定6次(n=6)。总黄酮(mg/g)=大果山楂提取液中总黄酮含量(mg)/大果山楂鲜果取样质量(g)。

(7)加样回收率试验

取总黄酮含量已知的大果山楂匀浆，加入一定量的芦丁对照品，按1.4.2节方法制备样品溶液6份，按1.4.3节步骤(1)显色后测定吸光度。

1.4.4 大果山楂黄酮提取液体外抗氧化活性测定

(1) DPPH自由基清除能力的测定

参照文献[15-17]方法，稍作修改。分别精密量取2.0 mL 1.4.2节供试品溶液稀释后所得的各浓度黄酮溶液 (0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)，与2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH 溶液混合摇匀，于室温下静置反应20 min，作为样品溶液。用95%乙醇调零，样品放入吸收池中，在517 nm处测定吸光度(A1)。使用相同体积的95%乙醇代替DPPH溶液(为对照组)，按上述条件混合和静置反应，测定其在517 nm 处的吸光度(A0)。空白组为2 mL 95%乙醇+2 mL DPPH溶液，按上述方法测定其在517 nm处的吸光度(A2)，以水溶性维生素E类似物Trolox为阳性对照物(浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)，平行测定3次，计算DPPH清除率，DPPH清除率(%)=[1— (A1—A2)/A0]×100%。不同产地大果山楂黄酮提取液对DPPH的清除能力，用半数清除浓度IC50表示。根据DPPH清除率，运用SPSS 19.0 进行Probit回归分析，计算10种产地大果山楂总黄酮提取液对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)，IC50值越小说明清除自由基的能力越强[18]。

(2)氧自由基吸收能力(ORAC)的测定

参照文献[7]进行ORAC的测定。标准品Trolox需配制成系列浓度(6.25，12.50，25，50 μmol/L)的溶液。配制75 mmol/L pH=7.4磷酸盐缓冲溶液,现配现用。待测样品用磷酸盐缓冲溶液稀释。具体操作步骤如下：在 96孔黑色底部透明微孔板相应的微孔中分别加入20 μL磷酸盐缓冲溶液(空白对照)或抗氧化物质(Trolox或待测样品)，37℃下暗处反应10 min；然后加入200 μL荧光工作液(荧光素钠)，在37℃下反应20 min；随后迅速在各个微孔中加入 20 μL自由基诱发剂ABAP 溶液，在多功能酶标仪中连续测定其荧光强度的变化(37℃，每5 min测定一次，总时长为150 min，激发波长为485 nm，发射波长为538 nm)。以Trolox为标准品绘制标准曲线，所有样品都进行3次平行试验。 根据抗氧化剂作用下的荧光熄灭曲线下面积(AUC)与空白对照孔(无抗氧化剂)自由基的AUC，计算抗氧化剂的荧光保护面积，即荧光熄灭曲线的延迟部分面积(Net AUC)。Net AUC的计算公式为Net AUC= AUCsample-AUCblank。根据Trolox浓度和Net AUC之间的回归方程来计算 ORAC值，并表示为每克样品(鲜质量)的Trolox当量[mg Trolox equivalents (TE)/g FW]。ORAC值越大，说明大果山楂黄酮提取液对氧自由基的吸收能力越强，其抗氧化活性越高[7]。

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

线性关系试验中芦丁浓度与吸光值间的回归方程为y=11.184x+0.0085，相关系数R2=0.998 3；芦丁质量浓度在0.008—0.064 mg/mL范围内线性关系良好。重复性试验中吸光度的相对标准偏差RSD为1.81%，表明该方法重复性良好；精密度试验中吸光度的相对标准偏差RSD为1.46%，表明仪器精密度良好；稳定性试验中吸光度的相对标准偏差RSD为2.14%，表明总黄酮溶液在显色后60 min内具有良好的稳定性；加样回收率试验中平均加样回收率为99.78%，相对标准偏差RSD为1.07%，表明该方法适合大果山楂总黄酮含量的检测。

2.2 大果山楂总黄酮提取方法的确定

将回流提取和超声提取的天峨县大果山楂进行总黄酮含量测定，回流提取法提取大果山楂总黄酮的平均得率为2.18%，超声提取法提取大果山楂总黄酮的平均得率为2.16%，结果表明两种方法的得率差异甚微。超声波具有空化、机械、热效应、乳化、扩散等效应，能使植物细胞壁破裂，加速大果山楂有效成分的释放、溶解及扩散；且提取温度低、时间短、提取效率高，因此选择超声提取法作为大果山楂总黄酮的提取方法。

2.3 大果山楂总黄酮含量

如表1所示，10种不同产地的大果山楂总黄酮含量为16.87—38.61 mg/g，其中广西靖西市的大果山楂总黄酮含量最高为(38.61±0.25) mg/g，约为广西德保县大果山楂总黄酮含量(16.87±0.22) mg/g的2.3倍。10种产地大果山楂总黄酮含量由高到低依次为M4(广西靖西市)> M10(广东信宜市)> M8(广西平乐县)> M6(广西昭平县)> M9(广西恭城县)> M7(广西钟山县)>M1(广西天峨县)>M5(广西长洲区)>M2(广西柳江区)>M3(广西德保县)。统计分析表明不同产地大果山楂总黄酮含量存在显著差异(P<0.05)。不同产地大果山楂总黄酮含量差异显著的原因可能与采收时间、栽培方式、品种和产地等因素有关。由于取样的局限性，本实验所收集的品种并不能完全代表各产地的质量差异，如深入研究则应进一步对其他成分或品种产地进行分析。

表1 10种不同产地大果山楂样品的总黄酮含量(n=6)

2.4 大果山楂总黄酮提取液体外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

实验表明DPPH自由基清除率随着总黄酮浓度增加而增大，在一定范围内具有明显的量效关系，而当浓度超过0.1 mg/mL后量效关系体现不明显，这与黄欣欣[19]的研究结果一致。如表2所示，10种产地大果山楂总黄酮提取液对DPPH自由基均有较好的清除能力。广西靖西市大果山楂总黄酮提取液对DPPH自由基的清除能力是10个样品中最强的，且略强于阳性对照Trolox，其半数清除浓度IC50=(0.048±0.006) mg/mL，其次为广东信宜市大果山楂IC50=(0.055±0.004) mg/mL，清除能力最弱的是广西天峨县大果山楂IC50=(0.059±0.007) mg/mL。各大果山楂总黄酮提取液对DPPH自由基清除能力(IC50)无显著差异(P>0.05)。

2.4.2 氧自由基吸收能力(ORAC)

从表3可知，不同产地大果山楂总黄酮提取液氧自由基吸收能力最强的是广西靖西市(39.35±0.42)mg TE/g FW，其次是广东信宜市(33.68±0.54)mg TE/g FW，最弱的是广西天峨县(24.06±0.74)mg TE/g FW，而且10种产地大果山楂总黄酮提取液的ORAC值存在显著差异(P<0.05)。 另外，ORAC值与大果山楂总黄酮含量趋势并不完全一致，一方面可能是各产地大果山楂果实含有的黄酮类化合物组成和含量不同导致的；另一方面在大果山楂总黄酮提取过程中不可避免地会有其他酚类[7]或维生素[9]等成分浸出，如绿原酸[20]、肉桂酸[21]和维生素C[22]等，这些成分组成和含量的差异也会影响总黄酮提取液的抗氧化活性。因此要全面掌握大果山楂果实抗氧化的物质基础，需对大果山楂果实中各类组成成分及含量进行深入分析。

表2 10种不同产地大果山楂黄酮提取液对DPPH自由基的清除能力(n=3)

表3 10种不同产地大果山楂黄酮提取液氧自由基吸收能力 (n=3)

3 结论

超声提取法提取大果山楂总黄酮的效果优于回流提取法，经方法学考察结果表明可见分光光度法适用于大果山楂总黄酮含量的测定。10种产地大果山楂总黄酮含量存在显著差异(P<0.05)，其中广西靖西市大果山楂总黄酮含量最高。另外，10种产地大果山楂总黄酮均具有良好的DPPH自由基清除能力和氧自由基吸收能力，因此可作为抗氧化剂的重要来源，但其具体的抗氧化活性成分还不明确，有待进一步探究。后续可考虑利用HPLC指纹图谱对大果山楂黄酮类及其他抗氧化物质进行全面的定性和定量分析，以期为大果山楂的原料和产品质量控制及食品、保健品等领域的开发利用提供更为科学的理论支撑。