基于UPLC-QTOF/MS法快速靶向筛查与测定克氏原螯虾中的三环唑

陈建武，彭婕，甘金华，杨总，张涛，何力*

(1.农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心， 农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(武汉)，中国水产科学研究院长江水产研究所， 湖北 武汉 430223; 2.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司， 上海 200335)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的稻虾轮作因绿色养殖、环境友好的新型养殖模式，可实现种养共生互利，增产增收的优势而被广泛推广。但同时，稻田以及虾塘周边农作物耕种过程中因所施用农药对稻田养虾的食用安全性而备受关注。在农作物生产中施用的除草剂、杀菌剂和杀虫剂等污染物存在由周围环境经排放灌溉、雨水径流等方式进入养殖水体等的现象，因其具有复杂和不确定性，给水产品食用安全性带来风险，已成为稻虾养殖模式下水产品质量安全的一大隐患和关注焦点[1-5]。有研究报道，多种农药极易通过雨水径流等方式流入水生系统中，在农作物周边水生态系统中常有检出[1-2，6-7]。

三环唑(tricycalzole)为中等毒性的内吸性三唑类杀菌剂，主要用于水稻稻瘟病防治，在水稻种植中被广泛应用[8-10]。三环唑属于低毒性的农用杀菌剂。有研究报道，三环唑对水生生态系统具有潜在的风险[6-7，11]，人体中毒后也会引起不同程度的不适症状[12]。三环唑在中国水产品中没有相关限量的要求[13]，在水产品的残留研究也少有报告[4]。目前，对三环唑的残留检测研究大都集中在农作物及其耕作土壤中，多采用高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法等检测方法[8-10，12-16]检测。近年来也有用超高效液相串联四级杆飞行时间质谱法或气相色谱串联四级杆飞行时间质谱法非靶向筛查粮谷中的农药残留，并检测到三环唑[3，17-19]的报道。克氏原螯虾中三环唑的筛查与检测方法尚未见报道，仅有通过静电场轨道阱高分辨质谱对水产品中农药残留的筛查[4]和通过高效液相色谱串联质谱对克氏原螯虾中的二甲戊灵残留的检测方法的研究报道[5]。以四级杆飞行时间质谱为代表的高分辨质谱分析检测技术具有较宽的扫描范围，较高的特异性、高质量准确度和高分辨率等优势被广泛应用于食品安全检测领域中的对农兽药残留的靶向和非靶向定性定量分析[3，4，17-27]。本研究采用超高效液相串联四极杆飞行时间质谱对克氏原螯虾肌肉中三环唑的残留进行靶向快速筛查，并借鉴有关文献方法，采用溶剂提取、QuEChERS前处理方法进行了定量分析，以期为检测克氏原螯虾中的三环唑残留提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

美国Agilent UPLC 1290串联QTOF 5600+(美国SCIEX公司)(配有MultiQuant3.0.2和MasterView®2.2数据采集分析软件)；分析天平(梅特勒-托利多 PL202-L)；超声波清洗机(上海科导SK5210LHC)；旋蒸仪(巩义市予华仪器RE-2000E)；涡旋振荡仪(SCILOG MX-F)；离心机(Sigma 3K15)。

三环唑标准品(纯度为99.6%，DR公司)；甲醇、乙腈及甲酸(均为JT Baker公司，色谱级)；无水硫酸镁和氯化钠(国药集团，分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

克氏原鳌虾剥壳去头、内脏并拔掉肠腺后，取肌肉部分处理成小于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，混匀，用高速绞肉机充分搅散均匀，用密封袋封好，标记并于-18 ℃冷冻备存。

1.2.2 提取

1.2.2.1 靶向筛查分析前处理

参照文献[4，22]进行前处理方法优化，并稍作修改。本筛查方法步骤如下：称取5 g(±0.01 g)肌肉于50 mL具塞离心管中，25 mL乙腈(含0.1%甲酸，V/V)提取，涡旋2 min，超声5 min，6 000 r/min离心5 min，重复上述步骤提取一次，合并上清液转移至125 mL鸡心瓶中，40 ℃减压旋蒸至近干，用1 mL的50%甲醇(含 0.1%甲酸)振荡超声溶解，过0.22 μm有机滤膜上机。

1.2.2.2 定量分析前处理

参照文献[4，14-17，22-23]，优化了样品前处理方法：称取2.00 g(±0.01 g)肌肉于50 mL具塞离心管中，加入25 mL乙腈(0.1%甲酸)后涡旋振荡1 min后，加入3 g无水硫酸镁、2 g氯化钠，涡旋2 min，超声5 min，6 000 rpm离心后，上清液转移至鸡心瓶，乙腈重复提取一次，合并上清液，40 ℃减压旋蒸至近干，用乙腈-水(1∶1,V/V)1 mL 复溶，转移至1.5 mL离心管中，加入20 mg的石墨碳化黑(GCB)和50 mg的酸性氧化铝(AL-A)后，涡旋混匀后超速离心，取上清液过0.22 μm有机滤膜上机。

1.2.3 标准溶液配制

准确称取适量的三环唑标准品，用甲醇配成100 mg/L的标准储备液，于-18 ℃冰箱中避光保存；用甲醇-水(1∶1,V/V)稀释标准储备液，分别配制成质量浓度为1 μg/mL、0.5 μg/mL的标准中间溶液，于-18 ℃避光保存。根据需要，吸取一定量的标准中间溶液，用水稀释成质量浓度为0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL的系列标准工作液。根据需要，采用前文1.2.2.2节前处理方法处理空白克氏原螯虾样品，制备得到空白样品溶液，用空白样品溶液稀释三环唑标准中间液，分别配制质量浓度为0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL的系列空白基质匹配标准溶液。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱温30 ℃，流速为0.3 mL/min，流动相A为0.1%甲酸(V/V)， B为甲醇。靶向筛查梯度洗脱程序：0～2 min，95% A；2～20 min，90%～5%A；20～28 min，5%A；28.1～35.0 min，90%A；进样量为20 μL。定量分析梯度洗脱程序：0～0.5 min，95% A；0.5～2 min，95%～85%A；2～5 min，85%～5%A；5～7 min，5%A；7.1～10 min，95%A；进样量为10 μL。

1.2.4 质谱条件

靶向筛查质谱条件：DuoSprayTM离子源，电喷雾电离(ESI)，正离子模式扫描，离子源温度为550 ℃；喷雾电压为5 500 V，去簇电压(DP)为80 V；雾化气(GS1)为45 psi；辅助雾化气(GS2)为45 psi；气帘气(CUR)为30 psi。积累时间为0.25 s，信息依赖性扫描(IDA)模式；IDA触发15个子离子扫描；碰撞电压为(35±15)eV，TOF MS进行全扫描，TOF MS /MS进行二级子离子扫描。

定量分析质谱条件：DuoSprayTM离子源，电喷雾电离(ESI)，正离子模式扫描，离子源温度为550 ℃；喷雾电压为5 500 V； GS1为45 psi； GS2为45 psi； CUR为30 psi；积累时间为0.25 s，采用MRMHR扫描，根据靶向筛查和质谱优化结果选择高灵敏模式来监测三环唑特征峰(190.0/ 136.0*，190.0/163.0，*为定量离子)，去簇电压为89 V，碰撞能为32 eV。

1.2.5 三环唑本地标准库建立及靶向筛查方法

将质量浓度为0.5 μg/mL的三环唑标准中间溶液经色谱柱分离后，在飞行时间质谱中进行全扫描(范围为100～1 000 Da)，并进行一定碰撞能范围内(±15 eV)的一级、二级离子碎片扫描，得到[M+H]+准分子离子和碎片离子的精确分子量，结合文献以及一级、二级图谱中的TIC图，在IDA图谱中找到碎片的精确分子量，色谱保留时间，同时将化合物名称、结构式、分子式和美国化学文摘登记号(CAS)等信息导入谱图文库，建立三环唑标准图谱，并用CSV格式输出保存，建立三环唑目标物靶向快速筛查的标准库。

仪器筛查方法的检索参数包括精确质量数偏差小于5 ppm(5.0×10-6)，信噪比小于3，峰响应阈值强度为2.0×103，同位素比值偏差小于20%，将前文1.2.2.1前处理样品采集信息和本地标准图谱库比较，设置靶向筛查权重因子(质量偏差因子0.3，同位素比值偏差因子为0.3，库匹配因子为0.4)，综合得分大于80，并通过二级碎片谱图匹配比对排除假阳性，视为确证三环唑阳性样品。

2 结果与讨论

2.1 三环唑标准库图谱及靶向筛查方法建立

药物靶向快速筛查主要基于QTOF的高分辨数据库，该数据库储存了化合物多方位谱图信息并进行了归类，但不同的仪器产生的化合物信息及响应均有所差异，因此需要建立本地标准库，图1为本地标准品库中三环唑的提取离子流色谱图。将三环唑化合物名称、结构式、分子式、精确分子量、CAS号及碎片离子精确质量数等所有相关信息导入本地专属三环唑数据库，并存储三环唑二级碎片离子谱图信息，结合MasterView定性筛查分析软件，用于和克氏原螯虾基质样品的一级、二级谱图相似度匹配。导入三环唑本地标准(后缀名.csv)，为降低检索数据量和复杂程度，加快匹配速度并提高准确性，按前文1.2.5中所述方法设置目标物检索参数，对目标物进行靶向快速确证。图2为克氏原螯虾基质添加三环唑标准溶液后的提取离子流图和一级、二级谱图对比图。

靶向筛查基于高分辨数据库，该库存储了专属化合物多方位信息。通过高分辨数据库结合化合物信息筛查对比确证功能的MasterView软件分析，利用专属库以及Library中存储的一定碰撞能下的二级质谱图，用于一级、二级谱图相似度镜像比对(图2)，能提供更有利的匹配条件，减少假阳性。通过前述检索参数设置，提高了筛查速度和筛查结果的准确性。经过对比，最终实际分析中的精确质量数偏差为2 ppm，与标准品保留时间差小于0.5min，MasterView软件计算综合得分在90.9左右，与标准品的二级碎片离子图谱质匹配比对通过，因此，确证通过，可进行下一步的定量分析。

2.2 定量分析方法

在建立三环唑本地谱图库后并与阳性样品筛查匹配时(图2)，发现三环唑有3个响应值较高的子离子，分别为(m/z)163.0，(m/z)136.0，(m/z)109.0，其中(m/z)136.0响应值最高，且相对特异性较高，因此选择(m/z)136.0作为定量离子，次高的为定性离子(m/z163.0)。

QTOF的靶向扫描模式可以通过质谱优化和高分辨率下MRM方法实现对农药污染物的定量检测。虽然缺乏净化步骤的前处理可以避免化合物漏检，但对于准确定量测定，需解决水产品基质干扰严重，检测灵敏度较低的问题[4，28]。克氏原螯虾肌肉中含有大量的蛋白质和脂肪，基质复杂，直接提取的回收率不理想，背景噪音也较高[4，28]，因此需要在提取后进行净化处理由于乙腈对三环唑具有良好的溶解性，且能沉淀部分蛋白质，因此直接采用乙腈进行提取，可避免漏检三环唑[4]。参考相关文献，按前文1.2.2.2前处理所述方法，本实验酸化乙腈提取之后，依次采用无水硫酸镁除水，饱和氯化钠盐析去除蛋白质，石墨碳化黑和酸性氧化铝去除克氏原螯虾肌肉中色素和脂肪后，采用MRMHM模式对克氏原螯虾肌肉中的三环唑中进行定量分析。将空白基质匹配的体积浓度分别为0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L 三环唑标准溶液，以MRMHM监测(190.0/136.0)定量离子的峰面积为横坐标，溶液浓度为纵坐标，采用MultiQuant 3.0.2软件绘制标准曲线回归方程：Y=694.34X+ 29.16，r=0.999 5。以3倍信噪比时的检测含量为检出限(LOD)，结果为0.5 μg/kg，定量限(LOQ)为1.0 μg/kg。上述结果表明QuEChERS方法能快速净化和除脂，线性相关良好，检测限较低，能满足检测要求。

2.3 基质效应

在优化的质谱参数下，按1.2.3所述，用三环唑标准储备液配置克氏原螯虾的系列空白基质匹配标准溶液，绘制标准曲线。采用基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率之比(M)评价基质效应[10]，比值越接近1，说明基质效应越小。结果表明，三环唑在克氏原螯虾肌肉中的基质效应(M)为0.34，存在较强的基质效应，最终采用空白基质匹配标准曲线进行定量。

2.4 回收率和精密度

以不含三环唑的空白克氏原螯虾肌肉为基质，采用基质加标法评价回收率和精密度。添加水平分别为0.5、10.0和20.0 μg/kg，每个水平重复6次。结果发现3个添加水平的回收率为65.15%～94.24%，相对标准偏差为5.31%～8.12%，其回收率和精密度均满足克氏原螯虾中三环唑残留检测要求。图3为空白基质添加水平为10.0 μg/kg的三环唑MRM色谱图。

2.5 实际样品测定

采用建立的快速靶向筛查方法对实验室2018年采集自稻田养鱼塘的重点水产品中的79个克氏原螯虾样品中的三环唑进行快速靶向筛查，对克氏原螯虾样品按前文1.2.2.1经通用前处理后，与三环唑标准品的高分辨二级碎片谱图数据库进行匹配，其质量数偏差小于5 ppm，谱图匹配度综合得分在80～100之间，通过二级碎片谱图比对后排除假阳性后，即可定性通过为阳性样品。同时克氏原螯虾样品按照前文1.2.2.2经提取、净化后，采用定量分析方法测定，结果均没有三环唑检出。郭思言等[4]对水产批发和零售市场上的水产样品进行了分析，发现样品中三环唑的检出率为1.2%，但检测对象没有涉及克氏原螯虾。本实验检测的克氏原螯虾样品均抽检自水质良好的稻田养虾塘，稻田养虾采取的是“虾稻共生”的绿色生态种养模式，即在一季稻田里养殖小龙虾，虾为稻“除草、松土、增肥”，稻为虾“供饵、遮阴、避害”。因此，三环唑的施撒行为可能性很少，实验室采样过程中调查采访抽样对象得知种稻养虾过程中没有使用三环唑，所以该年度所抽检的克氏原螯虾样品没有检测出三环唑。

3 结论

高分辨飞行时间质谱仪对阳性样品的定向筛查较为准确和快速，而经过定量方法优化后UPLC-QTOF-MS/MS对一些农药污染物的定量分析能力并不逊色于液相色谱串联三重四级杆质谱仪，远高于液相检测方法。本研究建立的基于UPLC-QTOF/MS法快速靶向筛查与测定克氏原螯虾中的三环唑方法，通过自建的本地专属三环唑标准数据库和Library库，结合MasterView筛查软件对克氏原螯虾中的三环唑进行靶向快速筛查分析并确证，并在此基础上采用QuEChERS方法对三环唑进行定量，并对稻田养虾塘中的克氏原螯虾抽检样品进行了测定。本方法筛查快速准确，定量检测的LOD、LOQ及回收率均能满足三环唑的检测要求，因此可用于克氏原螯虾可食肌肉中三环唑的快速靶向筛查和定量分析，同时也可为水产品中农药残留的快速筛查和定量检测提供参考。