浅析RNA干扰技术及其应用

姜汶辰

摘 要：RNA干扰（RNAi）技术是体外敲除目标基因最常用方法之一。该技术利用小干扰RNA，实现目标基因的沉默。RNA干扰可能与植物的共抑制、抗病毒机制、基因调控和染色体修饰等调控过程有关。利用遗传和生化分析方法，我们可以对RNA干扰技术的效果进行更准确的评估。RNA干扰技术的特异性极高，是基因组学的重要研究工具，并可以用于基因治疗。本文简要介绍了RNA干扰技术的原理及其应用，以期为相关人员提供参考。

关键词：RNA干扰技术;基因;mRNA;应用

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2020）10-0203-02

0引言

RNA沉默是一种新型的基因调节机制，可通过抑制转录或激活序列特异性RNA降解过程来限制转录水平。在几乎所有真核生物中，都存在与RNAi相关的事件，原生动物、昆虫、寄生虫以及小鼠和人类细胞系中，都存在RNA干扰现象。此外，RNAi可能与异染色质的形成有关。深入研究小RNA在细胞的代谢中发挥的作用，有助于我们更好地理解基因表达调控机制。

随着基因组学的发展，许多生物学家对RNAi在基因表达中的作用进行了深入的研究。在对果蝇进行分析的过程中，科学家发现，RNAi可能與各种真核细胞对自身基因突变的反应相关。RNAi机制可以抑制转座子的动员，避免重复性DNA的积累，从而维持基因组的完整性。RNAi机制还可以保护细胞免受病毒感染的影响，并调节细胞基因的表达。作为一种比较成熟的技术，RNA干扰技术成为了分子生物学家最常用的基因研究工具之一，其在基础生物学研究、医疗、农业等领域都有着十分广泛的应用。如果我们找到合适的递送方式，确保小RNA在转入人体后不被核酸酶降解，那么这些小RNA将高效地抑制靶基因表达。这将为传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗提供新策略[1]。

1 RNA干扰技术的简介

在动物中，双链RNA会引起相应基因的沉默，这种现象被称为RNA干扰。它是一种非常原始和保守的机制，可能与细胞和外来DNA的相互作用有关。在RNAi的过程中，核酸酶首先将较长的RNA切割成较小片段的双链RNA（dsRNA），这些小RNA将充当诱导物或激活剂，破坏细胞或病毒的靶mRNA分子。在某些情况下，靶mRNA的DNA会发生甲基化，使基因的表达水平进一步降低。

然而，RNA干扰技术仍然存在一定的局限性。在利用siRNA治疗疾病的过程中，科学家发现，siRNA有时会导致非目的基因沉默，影响细胞的正常代谢过程。此外，一些siRNA可能会被体液中的核酸酶降解，影响治疗效果。运用分子生物学知识，科学家可以不断改进siRNA的合成技术，这将提高siRNA的稳定性，提高其治疗效力，并降低脱靶效应。不断改进RNAi试剂，不断改进RNA干扰技术，可以提升基础生物学及医学研究的可靠性，并为治疗癌症及遗传性疾病提供新思路[2]。

2 RNA干扰的作用机制

RNA干扰过程主要有2个步骤：首先，长双链RNA（dsRNA）被细胞内的核酸酶切割降解成21个～23个碱基对的短双链RNA，也就是小干扰性RNA（siRNA）。然后，siRNA可以与细胞源性的某些酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体（RISC），该复合物通过碱基互补配对，识别靶mRNA并介导其降解，从而导致特定基因沉默[3]。

3 RNA干扰技术的研究进展

选择合适的目标序列是有效提高siRNA干扰效率的关键。目标序列中特定核苷酸的含量及目标序列的二级结构，都可能影响干扰效率。研究表明，通过计算机辅助RNA折叠程序（MFOLD），我们可以预测siRNA与目标序列的配对情况。然而，这些预测并不总是正确的。在一些情况下，在MFOLD中评分很高的siRNA，不能很好地降低目标基因的表达水平。利用相关实验判断所选目标序列是否合适，可能是更高效的。通过研究寡核苷酸与mRNA的体外结合情况，是一个较常用的确定目标序列的方法。当寡核苷酸与mRNA结合为复合物后，加入可切割RNA-DNA杂合体的RNase H，共同孵育一段时间，RNase H就可以将复合物裂解。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，就可以分析裂解产物，评估目标序列。不过，这种方法有一定的局限性，与细胞内的mRNA相比，人工合成的mRNA的二级结构更简单。研究人员发现了一种更可靠的方法。他们从细胞中提取天然状态的RNA蛋白复合物，将提取物与寡核苷酸一起孵育，待它们结合成复合物后，用内源性的RNAse H切割复合物，并验证产物。这种方法可以最大程度地模拟寡核苷酸与mRNA的结合情况，得到更可靠的结果。

4 RNA干扰技术的应用

RNA干扰技术是一种以序列特异性方式抑制基因表达的强大工具。利用RNA干扰技术，我们可以高效地研究基因的功能。siRNA诱导的基因沉默在生物技术、医学领域及农业中有着十分广泛的应用。下面我们简要介绍RNA干扰技术的应用。

4.1 RNA干扰技术在农业领域的应用

在农业领域，我们可以应用RNA干扰技术，增强作物的抗寒抗旱能力或者降低害虫的繁殖能力，从而增加作物的产量。靶向与生殖相关基因的siRNA，可能会导致雄性害虫不育，这可能是控制害虫的新方法。转基因诱导的RNA沉默还可以用于抑制植物特定基因的表达，从而增强植物对病毒或细菌的抗性。不过，科学家还不清楚，RNA干扰技术的应用是否会改变植物其他方面的性质。也就是说，含dsRNA的植物，是否会对人类和环境产生潜在的影响，目前还是未知数[4]。我们需要深入研究RNA干扰技术对环境造成的可能影响，避免转基因植物破坏生态平衡。此外，我们还需要深入研究摄入含dsRNA的食物对消费者的影响，从而更全面、更准确地评估这类转基因食物的安全性。

4.2 RNA干扰技术在基础生物学研究领域的应用

我们可以利用RNA干扰技术，高效地研究基因的功能。当我们确定目的基因的序列后，可以设计相应的dsRNA，并将其导入细胞或动物模型，从而改变基因的表达水平。如果在基因表达下降后，细胞内其他基因的表达水平也随之发生变化，就说明这些基因可能存在相互作用。相比于其他基因编辑技术，RNA干扰技术的操作十分简便，且编辑效率高是研究基因功能的首选技术。

许多研究表明，利用RNA干扰技术，我们可以高效地分析基因与表型之间的关系，确定基因的功能。然而，对于序列未知的基因，我们无法设计合适的dsRNA，也无法利用RNA干扰技术研究其功能[5]。测序技术的发展可能有助于解决这一问题，在得到研究对象的基因组序列后，我们可以高效地利用RNA干扰技术研究对应基因的功能，从而理解不同基因在疾病发生中的作用。

4.3 RNA干扰技术在医药领域的应用

随着人类基因组计划的完成，我们可以高效地选择目的基因进行基因治疗。在确定目的基因的序列之后，我们可以借助一些软件，高效地设计治疗性siRNA，实现基因治疗。

siRNA疗法与传统的基于小分子和抗体的疗法有许多不同点。其主要优势在于利用siRNA，我们几乎可以使任何一个基因沉默。而抗体类药物只对一部分基因突变有效果。从治疗机理角度来看，siRNA可以直接拮抗靶标，而传统药物主要通过阻断或激活其靶基因的功能来发挥作用。相对而言，siRNA是更高效的。此外，与传统药物相比，我们可以更快地发现和鉴定特异性的siRNA，缩短研发周期，节约研究资金，而且siRNA选择性和效力要比传统药物高得多。

siRNA的性质十分特殊，这可能会影响其在体内的有效性。在静脉内给药时，一些siRNA会因为分子量较小被肾脏滤除;在血液循环中，一些siRNA会被内源性酶降解。在细胞表面，一些siRNA因为分子量过大和表面带负电，无法穿过细胞膜。一系列研究表明，在静脉给药后，大多数裸siRNA分子在体内的半衰期是30min。用化学方法修饰siRNA，有助于延长siRNA在血液循环系统中的寿命。化学修饰和物理包裹，可能会改变siRNA在体内的理化性质，从而提高其治疗效力。例如，放射性标记的Chol-siRNA的消除半衰期为95min，而未偶联的siRNA的半衰期仅为6min[6]。

此外，我们应当对siRNA的递送策略进行更深入的研究，从而保证siRNA在进入人体后，不被核酸酶降解，正常发挥作用。自从第一种基于siRNA的药物于2004年进入临床试验以来，各个国家的科学家对RNAi治疗剂的性能进行了深入的研究，他们比较应用裸siRNA、化学修饰的siRNA及赋形剂介导的siRNA治疗局部或全身性疾病的效果，通过分析这些信息，我们可以总结出有效和安全的递送策略，助力基因治疗的发展。

siRNA的特异性是另一个十分值得关注的问题。siRNA与其靶标之间的单个错配就足以显著降低siRNA的治疗效果。然而，我们仍不清楚错配的数量和位置与siRNA的干扰效率之间的联系。siRNA可能会靶向具有相似序列的多个基因产物，从而影响其他基因的表达。

研究表明，针对同一mRNA的不同序列的siRNA的干扰效率存在差异，这一现象可能与siRNA进入靶mRNA互补区域的能力有关。在设计siRNA的过程中，我们应当将提高siRNA的干扰效率作为主要设计目标，从而提升siRNA的治疗效率。此外，如何鉴定所设计的siRNA的有效性是一个十分重要的问题。将siRNA测试与复杂的基因表达分析技术相结合，可能会帮助研究人员准确评估所设计的siRNA的有效性及特异性，提升基因治疗的效率[7]。

5结语

由于RNA干扰技术的特异性较强，可以强烈抑制靶基因的表达，RNA干扰技术的应用十分广泛，在细胞培养、活体器官和疾病模型研究中，RNAi都扮演着重要的角色。然而，我们仍然不确定。基于RNAi的策略是否可以用于治疗与基因突变或基因异常表达相关的疾病。研究人员应当保持审慎的乐观态度，对siRNA的性质进行更深入的研究，开展更大规模的临床试验，从而助力基因治疗的发展。

参考文献

[1] 朱乃甫，和立挺，邓凯.RNA干扰技术及其应用前景[J].生物技术世界，2013（5）：4-5.

[2] 杨谦，赵惠贤.RNA干扰技术及其应用研究进展[J].西北农业学报，2005（2）：13-17.

[3] 杨学智，武娜，张芝莲.RNA干擾技术及其应用[J].临床医药实践，2011，20（3）：212-213+216.

[4] 郑亚婷，段勇，王玉明.RNA干扰技术及其应用[J].医学综述，2010，16（5）：641-644.

[5] 陈若飞.RNA干扰技术及其应用研究[J].畜牧与饲料科学，2009，30（5）：49-51.

[6] 崔照琼，王旭东.RNA干扰技术研究进展及其应用[J].中国畜牧兽医，2005（3）：27-31.

[7] 费凌娜，王启钊，许瑞安.RNA组合干扰技术及其在肿瘤基因治疗中的应用[J].药学学报，2012，47（5）：573-579.