黄地老虎成虫对15种植物挥发物的电生理和行为反应

2020-10-27修春丽陆宴辉

新疆农业科学 2020年11期

李琳，修春丽，路伟，陆宴辉

(1. 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830091；2. 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3. 中国农业科学院茶叶研究所，杭州 310008)

0 引言

【研究意义】黄地老虎Agrotissegetum(Denis et Schiffermüller)属鳞翅目夜蛾科，幼虫俗称切根虫、土地蚕等，在我国分布广泛，其中华北、新疆、内蒙古、甘肃、青海等地的发生比较严重[1]。黄地老虎是一种多食性害虫，寄主植物多达100余种，主要危害棉花、小麦、玉米、高粱、马铃薯、甜菜、苜蓿、以及多种瓜类和蔬菜等作物。黄地老虎1～2龄幼虫为害较轻，自3龄以上幼虫为害逐渐加重，能咬断幼苗近地面的茎部，造成作物整株死亡和田间缺苗断垄。黄地老虎幼虫昼伏夜出，白天生活在土壤中，夜晚出来取食为害，给防治带来了很大的难度，亟待寻找和发展新的防治方法。【前人研究进展】植食性昆虫主要利用植物释放的挥发性物质来辨别寄主和非寄主、以及偏好寄主和普通寄主，植物挥发物在昆虫寄主植物的选择过程中常起着决定性作用[2-4]。每种植物的挥发物组分种类众多，通过对吸引昆虫的活性组分进行鉴定、筛选与利用，可以研发昆虫食诱剂产品及其行为调控措施[5]。目前，夜蛾、实蝇等多类害虫的食诱剂已被成功研发[5,6]，并在棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)等一些重要害虫的成虫种群监测与防治中取得明显效果[7-9]。前期研究发现，在众多寄主植物中，黄地老虎成虫偏好在棉花、苘麻、芝麻、龙葵和灰藜等寄主植物上产卵，表现出了明显的寄主偏好性[10-11]，但黄地老虎对寄主植物挥发物及其组分的电生理和行为反应缺乏研究。【本研究切入点】遴选棉花、苘麻等黄地老虎寄主植物中常见的15种挥发性物质，通过EAG测试黄地老虎雌性成虫对每种物质的电生理反应，同时通过风洞测定对各种物质的选择行为。【拟解决的关键问题】测试黄地老虎雌性成虫对不同挥发物的电生理以及行为反应，验证植物挥发物在其寄主选择中的重要功能，并筛选出对黄地老虎有显著吸引作用的挥发性物质，为研发成虫食诱剂奠定物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫

黄地老虎为室内种群，采用中国农业科学院植物保护研究所自行研制的人工饲料进行继代饲养，养虫室条件为温度(26±1)℃、湿度60%±10%RH、光照L∶D=14∶10 h。选择形态完整且健康活跃的个体作为试虫。

1.1.2 供试样品

选用棉花、苘麻等黄地老虎寄主植物中常见的15种挥发物，列出各种挥发物及参照化合物正庚醛的标准样品。表1

表1 供试化合物Table 1 Information on tested compounds

1.1.3 供试仪器

触角电位仪EAG(Syntech，荷兰)由电极固定器、触角固定器PRG-2、探头数据采集控制器 IDAC-2、气味刺激控制装置 CS-55 和触角电位记录显示输出装置组成。

风洞装置为自行设计，由透明有机玻璃制成，长210 cm、高90 cm、宽80 cm。气流设定为0.3 m/s，周围环境保持黑暗，仅开启风洞上方的红光灯，室内温度保持(25±1)℃、湿度(60±5)%RH。

1.2 方法

1.2.1 植物挥发物的EAG测试

用已知对地老虎类害虫成虫具有较好引诱作用的绿叶气味物质正庚醛作为参照[12]，进行触角电位反应测定。将每种挥发物标准化合物分别配制为5个浓度梯度，依次为：100、10、1、0.1、0.01 ng/mL，配制100 ng/mL的稀释液，依次稀释10倍，配置完成其余浓度梯度的稀释液。将配制完成的5种浓度梯度的稀释液用移液枪取10 μL，分别滴加到对折的滤纸条(0.5 cm宽×5 cm长)上，之后迅速的把滤纸条放进巴斯德玻璃滴管内，两端用锡箔纸封好，制备好触角后作为刺激味源使用。滴加有100 ng/mL正庚醛的滤纸条做为参照，滴加10 μL石蜡油的滤纸条做为对照。

将2～4日龄活跃的黄地老虎成虫冻晕后其置于解剖镜下，用解剖剪沿黄地老虎单根触角基部剪下。检查触角的完整性，触角完整即可进一步试验。用双面刀片将此触角尖端切去一小节，将参考电极(涂抹导电胶)与触角基部连接，放置到EAG微操做台上，将触角的尖端与记录电极的毛细管相连，EAG系统通过两个电极中的银丝相连通。将EAG微操作台整体搬运至气相色谱玻璃管出样口处，等待1～3 min直到触角电位信号稳定，开始记录触角电位反应值。每头黄地老虎先测试对照化合物(石蜡油)，然后测试参照化合物(正庚醛)，再测试供试挥发物，测试挥发物按照从低浓度到高浓度依次进行测试，再对参照和对照化合物进行刺激测试。将巴斯德滴管的尖端通过管壁上的小孔(距离管口约11 cm)插入到钢管中(深度约为3 mm)，每次刺激时间为0.5 s，两次刺激的间隔时间30 s，每个物质各重复10次。

EAG仪器通过IDAC-2信号采集器与计算机相连。触角距离钢管口大约3 mm，600 ml/min的气流经过活性碳和加湿瓶进入钢管(长度14 cm，内径8 mm)然后携带刺激源吹向触角。试验过程中室内温度保持(25±2)℃，湿度(70±5)%RH。

1.2.2 植物挥发物的风洞测定

将植物挥发物配置成浓度为100 μg/mL的稀释液，用移液枪取10 μL配制好的溶液滴加到滤纸条(宽0.5 cm×长5 cm)上，放置于装置上风口的试验台上，试验台高30 cm，距上风端20 cm。试验用雌性成虫单头引入风洞装置下风口的观察记录黄地老虎成虫的起飞方向：逆风(飞向滴有活性物质的滤纸条)且越过装置二分之一处，和顺风(远离滴有活性物质的滤纸条)，并分别记录试虫选择时间。若黄地老虎雌性成虫静止不动3 min，或起飞后触及风洞任意壁且停留时间超过5 s即结束试验。每种物质共测试60头雌虫，每组测试20头，重复3次。

1.3 数据处理

在每种测试化合物刺激之前和之后，对照和标准化合物的EAG振幅值取平均值。然后根据公式(CT-CK)/(CF-CK)计算相对EAG响应值，CT：被测刺激的EAG振幅值；CK：对照(石蜡油)的平均EAG振幅值；CF：参照物质(正庚醛)的EAG平均振幅值。风洞试验用X2检验黄地老虎成虫在两个方向间是否呈假设H0为50：50的理论分布，计算X2的值和相应的显著性水平P值。在风洞中静止不动的黄地老虎雌性成虫不计入统计分析内。

2 结果与分析

2.1 黄地老虎雌性成虫对15种植物挥发物的电生理反应

研究表明，黄地老虎雌性成虫对4种测试植物挥发物均没有明显的EAG反应，但对其余11种植物挥发物产生了较强的EAG反应。黄地老虎雌性成虫对癸烷、对乙基苯乙酮、2-甲基壬烷和3,3-二甲基辛烷未产生明显的EAG反应，且随着挥发物浓度的增加，EAG相对反应值基本没有变化。黄地老虎雌性成虫对1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、桉叶油醇、乙酸叶醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、罗勒烯和β-蒎烯的EAG反应随着挥发物浓度的增加而增加，浓度较小时基本不产生电生理反应，在最大测试浓度100 μg/ml时产生强烈的电生理反应，其中，黄地老虎雌成虫对丁酸丁酯和壬醛的反应相对于其它挥发物更强烈。图1

注：1: 1,2-二乙苯; 2: 1,4-二乙苯; 3: 丁酸丁酯; 4: 癸烷; 5: 4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯; 6: 对乙基苯乙酮; 7: 桉叶油醇; 8: 乙酸叶醇酯; 9: 芳樟醇; 10: 2-甲基壬烷; 11: β-月桂烯; 12: 壬醛; 13: 3,3-二甲基辛烷; 14: 罗勒烯; 15: β-蒎烯

2.2 黄地老虎雌性成虫对15种植物挥发物的行为反应

研究表明，1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、癸烷、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、对乙基苯乙酮、桉叶油醇、乙酸叶醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、3,3-二甲基辛烷、罗勒烯和β-蒎烯14种寄主植物挥发物对黄地老虎雌虫具有显著的吸引作用，成虫逆风趋向供试挥发物的数量显著高于顺风趋向对照石蜡油的数量(1,2-二乙苯：X2=7.02，df=1，P=0.008；1,4-二乙苯：X2=3.88，df=1，P=0.049；丁酸丁酯：X2=8.82，df=1，P=0.003；癸烷：X2=7.02，df=1，P=0.008；4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯：X2=14.02，df=1，P<0.001；对乙基苯乙酮：X2=29.26，df=1，P<0.001；桉叶油醇：X2=4.34，df=1，P=0.037；乙酸叶醇酯：X2=4.50，df=1，P=0.034；芳樟醇：X2=6.28，df=1，P=0.012；β-月桂烯：X2=33.02，df=1，P<0.001；壬醛：X2=4.32，df=1，P=0.038；3,3-二甲基辛烷：X2=13.28，df=1，P<0.001；罗勒烯：X2=14.80，df=1，P<0.001；β-蒎烯：X2=13.26，df=1，P<0.001)。其中，β-月桂烯和对乙基苯乙酮在风洞中对黄地老虎雌虫的吸引力最强，在测试的60头黄地老虎雌虫中，分别有50头和46头雌虫逆风趋向β-月桂烯和对乙基苯乙酮。但2-甲基壬烷处理中，黄地老虎成虫的趋向行为不明显(X2=0.62，df=1，P=0.431)。图2

3 讨论

目前关于黄地老虎的研究，主要集中在生物学特性、发生与防治以及性信息素鉴定等方面[13-16]。试验通过EAG技术测试了黄地老虎雌性成虫对棉花等主要寄主植物中几种常见挥发物的触角电生理反应，并在风洞中筛选出了对黄地老虎成虫具有较强引诱作用的活性物质，证实了黄地老虎成虫对植物挥发物的嗅觉识别功能。Hallberg研究了黄地老虎成虫触角上的感器类型，共4种，其中包括在各种昆虫中主要行使嗅觉识别功能的毛形感器和锥形感器[17]，为研究结果提供了直接证据。研究为黄地老虎植物源引诱剂及其行为调控技术的研发提供了理论依据并奠定了物质基础。

EAG结果表明，黄地老虎雌性成虫对一些植物挥发物的触角电位值均随浓度的升高而升高，这与许多鳞翅目其他昆虫的研究结果相一致。例如，烟青虫和棉铃虫对正己醇、(-)-里那醇等6 种植物挥发物的EAG剂量反应，均随着刺激物质浓度的增大而增强[18]；雌性桃蛀螟触角对玉米花丝气味物质1-己醇、1-庚醇、β-蒎烯和β-紫罗酮的EAG反应随浓度的增加，反应强度增加迅速[19]。昆虫的触角离体后，随时间的推移触角活性会逐渐下降，因此本试验挑取活跃的黄地老虎成虫进行触角电位试验，剪下后立即进行EAG测试，保证触角的活性。在进行EAG试验时，触角反应的绝对值受多种因素的影响，如载气流速、温度、前次反应对后次反应、样品管与触角之间的距离等因素的影响。试验中采用参照物质正庚醛标定触角的活性，测试得到的触角电位值是对于参照物质的相对值，可以有效地消除上述因素的影响。

风洞试验发现对乙基苯乙酮、癸烷和3,3-二甲基辛烷对黄地老虎雌性成虫的引诱能力明显，而EAG测试时不能引起黄地老虎成虫触角明显的电位反应。电生理和行为反应的不一致的现象，在植食性昆虫的嗅觉研究中经常发现[20-22]。昆虫对植物挥发物的反应行为常受到自身生理状况、环境因素等各方面因素的综合影响，这往往是两者结果不一致的原因所在。除对乙基苯乙酮、癸烷和3,3-二甲基辛烷外，黄地老虎对其余物质情况的EAG反应强度和风洞行为趋性基本一致。黄地老虎雌性成虫对不同挥发物的风洞试验中，观察到多数逆风飞向测试物质一侧，但很少降落在引诱物质上，可能是由于测试的是单一活性物质，对成虫的引诱能力不如植物本身释放的多组分挥发物。不同挥发物组分之间可能存在着增效等不同作用，有待进一步研究，另外还需进行单一和混配活性物质的田间引诱效果验证，这更有助于对吸引效果的确认和评估。

另外，颜色、大小和轮廓等固有性质也是影响昆虫辨别植物的强烈信号，昆虫能够利用这些视觉信号搜索寄主；远距离时，昆虫主要依靠植物轮廓定位寄主，近距离时，寄主的大小，颜色和形状发挥重要作用[23,24]。颜色信号在黄地老虎寄主选择行为的作用与功能，同样值得进一步探讨。

4 结论

通过EAG测试黄地老虎雌性成虫对棉花等主要寄主植物中常见的15种挥发物组分的电生理反应，对1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、桉叶油醇、乙酸叶醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、罗勒烯和β-蒎烯产生了明显反应，对测试的最大浓度100 μg/mL的反应最强烈。利用风洞测定黄地老虎雌性成虫对15种植物挥发物的行为选择，其中1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、癸烷、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、对乙基苯乙酮、桉叶油醇、乙酸叶醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、3,3-二甲基辛烷、罗勒烯和β-蒎烯对成虫有显著的引诱作用。