3.0T DCE-MRI定量参数联合外周血micro RNA21t和金属硫蛋白-1E对乳腺癌诊断价值

王琳琳，刘源源

乳腺癌是女性癌种中第1大癌症且近年来发病率逐年上升，渐趋年轻化。主要治疗方式为改良根治术、保乳术等，其中早期乳腺癌患者经治疗后生存率高达90%[1-2]。肿瘤新生血管与肿瘤的发生、发展密切关联，DCE-MRI可通过动态监测对比剂在肿瘤微循环中分布从而定量评估肿瘤血管情况如肿瘤新生血管密度、血管通透性等。肿瘤微环境中血管丰富以及通透性高、血流迅速，故而对比剂在微循环中代谢、分布相关常数偏高[3-4]。分子生物学快速发展，对乳腺癌研究逐步转入基因、蛋白组学水平，蛋白分子、miRNAs与肿瘤增殖、迁移、侵袭密切关联，micro RNA21通过调节抑癌基因、细胞分化及细胞凋亡(抑制程序性细胞死亡因子表达)等作用促进肿瘤生长[5]，金属硫蛋白-1E可能通过上调Cyclin D1使得细胞进入S期，从而导致细胞增殖、凋亡失衡，引起细胞恶化[6]。肿瘤发生、发展中肿瘤血管新生以及肿瘤细胞恶性增殖是关键因素，其中DCE-MRI检测可有效评估血流状态，而血清金属硫蛋白-1E、micro RNA21则可反映肿瘤恶性增殖、侵袭等生物学过程且已有研究发现DCE-MRI、血清因子联合诊断良恶性肿瘤、转移等具有良好效能[7]，故而推测联合检测可提高DCE-MRI诊断效能。本文探讨3.0T DCE-MRI定量参数联合外周血micro RNA21、金属硫蛋白-1E对乳腺癌诊断价值。

材料与方法

1.一般资料

回顾性研究2017年2月-2019年10月收治156例乳腺病变患者(共164个病灶)，年龄28～52岁，平均年龄(38.58±4.98)岁。根据组织病理学检测结果显示良性肿瘤60例，恶性肿瘤96例。本次研究已获得伦理委员会批准。

纳入标准：①临床触诊、乳腺钼靶X线检查或者超声检查初诊为乳腺病变，并同意3.0T动态增强磁共振成像检查；②既往未接受放疗、化疗、靶向治疗；③图像清晰，没有明显运动及呼吸伪影；④检查1周内经组织病理学检查确诊。排除标准：①严重伪影，影响图像质量，病理病灶与MRI检查病灶不对应；②怀孕、哺乳期妇女；③检查禁忌症如对比剂过敏者。本次研究纳入初始病例数162例，剔除影像资料不清晰、病历资料不完整病例，最终纳入156例。

2.检查方法

影像学检查:采用3.0T DCE-MRI磁共振扫描仪(德国西门子有限公司Magnrtome Skyra)进行检查，选取8通道双侧乳房相控线圈。指导患者取俯卧位，保证双侧乳房自然悬垂于线圈内，扫描范围为双侧乳腺组织和腋窝。扫描序列：横轴面T2WI，设置扫描层厚3 mm，层间隔1.5 mm，TR/TE为4060 ms/70 ms，FOV 340 mm×340 mm以及采集矩阵358×448。横轴面DWI：设置扫描层厚2.5 mm，层间隔0.5 mm，TR/TE为5700 ms/66 ms，b值分别为0、800 s/mm2。T1多翻转角(T1-mapping)：TR/TE为5.64 ms/2.46 ms，翻转角分别为5°、10°、12°、15°。T1动态增强序列：注射对比剂前扫描，约扫描40 s时则按体重采用高压注射器于前臂静脉团注磁共振对比剂(钆双胺，美国GE公司)0.1 mmol/kg，流率2.5 mL/s，注射完成后追加15 mL生理盐水，连续采集5期增强图像，总扫描时相70次，其中第1时相17.3 s，之后时相4.58 s，总扫描时间5～6 min。

MRI数据处理：将动态增强图像导入Omni-Kinetics软件(GE公司V2.0.10软件)并结合DWI、T2WI、灌注图像确定病变范围和具体位置。选取肿物实质成分强化最明显处为感兴趣区，即为病灶中央，选取3～5个ROI，面积≥2 mm2，尽量避开坏死、囊变以及出血区域，每个病变区测量3次取均值。以病灶感兴趣区层面主动脉为输入动脉拟合获取动脉输入函数，并借助Extended Tofts线性模型计算定量参数：速率常数(Kep)为组织间对比剂重新回到血管内速率常数；容量转移常数(Ktrans)为对比剂从血管内扩散到血管外速率常数，血管外细胞外间隙容积比(Ve)则为Ktrans、Kep比值，是血管外细胞外间隙占整个体素容积比。

图1 DCE-MRI影像学检查。女，38岁，乳腺浸润性导管癌Ⅲ级。a) 动态增强扫描见片状强化，边界模糊，形态不规则，左乳血管明显强化、增粗; b) 左乳外上象限腺体中后1/3处呈现异常信号， T1WI呈稍低信号。ADC值0.840×10-3mm2/s。

血清金属硫蛋白-1E表达水平测定 所有患者入组后清晨空腹抽取外周肘静脉血5 mL，3000 rpm离心10 min，取上层血清保存于-80℃待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清金属硫蛋白-1E水平，取金属硫蛋白-1E配制标准品溶液，在酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)上测得各溶液对应吸光度值(OD)，以OD值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，将测得的OD值代入标准曲线计算得各样品浓度，所有操作步骤均参照说明书进行，检测试剂盒购自中国台北亚诺法生技股份有限公司。

血清micro RNA21表达水平测定 采用TRIzol试剂盒(赛默飞世尔中国公司)提取血清总RNA，然后使用反转录试剂盒(赛默飞世尔中国公司)将总RNA进行反转录，得到模板单链cDNA，调整模板浓度至400 ng/μL，使用PCR试剂盒对cDNA进行PCR，反应条件为95℃ 预变性1 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸34 s，连续循环40次。以U6作为内参因子，根据micro RNA21与U6的Ct值计算相对表达量，以2-△△Ct表示相对表达量，其中△△Ct=(Ct结肠癌目的基因-Ct结肠癌U6)-(Ct对照目的基因-Ct对照U6)。

3.统计学分析

结 果

1.两组患者基线资料比较

两组患者入组前基线资料(表1)差异无统计学意义(P>0.05)。组织病理学结果显示良性组患者60例，恶性组96例。156例患者共有164个病灶，其中良性组62个，恶性组102个。良性组病理类型包括纤维腺瘤41例，囊肿10例，浆细胞性乳腺炎9例。恶性组病理类型包括浸润性导管癌67例，粘液腺癌7例，导管原位癌伴微浸润22例。

表1 基线资料

2.两组患者外周血micro RNA21和金属硫蛋白-1E水平比较

恶性组患者micro RNA21、金属硫蛋白-1E水平显著高于良性组(P<0.05，表2)。

表2 外周血micro RNA21、金属硫蛋白-1E水平比较

3.两组患者3.0T DCE-MRI定量参数比较

恶性组患者Ktrans、Kep、Ve均显著高于良性组患者(P<0.05，表3)。良性患者、恶性患者典型病例3.0T DCE-MRI图(图2、3)。

表3 两组患者3.0T DCE-MRI定量参数比较

4.3.0T DCE-MRI定量参数与外周血micro RNA21和金属硫蛋白-1E水平相关性

Ktrans、Kep、Ve分别与外周血micro RNA21、金属硫蛋白-1E水平具有正相关性(P<0.05，表4)。

5.3.0T DCE-MRI以及外周血micro RNA21和金属硫蛋白-1E诊断价值

表5 不同检查方法诊断效能比较 [n(%)]

图2 女，42 岁，左乳良性占位。a)横轴面 DCE-MRI 图，TIC 曲线，见左乳内上肿块影；b) Ktrans; c) Kep; d) Ve 伪彩图，红色最亮处为病灶强化最明显,Ktrans、Kep、Ve值分別为0.053/min、0.533/min、0.125。图3 女，40 岁，右乳浸润性导管癌。a) 横轴位面DCE-MRI 图，TIC 曲线,见右乳内上强化肿块影，边缘见毛刺影；b) Ktrans ;c) Kep;d) Ve 伪彩图，红色最亮处为病灶强化最明显,Ktrans、Kep、Ve值分別为0.159/min、1.166/min、0.145。

因子micro RNA21金属硫蛋白-1EKtrans(min-1)0.666,0.0000.597,0.000Kep (min-1)0.490,0.0000.497,0.000Ve0.463,0.0000.376,0.000

讨 论

影像学方法在乳腺癌早期诊断以及预后评估中越来越重要，其中MRI诊断早期乳腺癌敏感度高达90%。但乳腺MR诊断一般基于动态增强定性、半定量分析，其中定性分析诊断恶性病变时呈现出有一定重叠II型曲线，而半定量分析在高时间分辨率下仅能完成肿瘤区局部灌注，或者完成双乳扫描时间分辨率较低，故而对于乳腺癌良性、恶性诊断效能有待改善[8-9]。乳腺癌是血管依赖性肿瘤即其的发生、发展以及转归与血管新生关系密切，肿瘤新生血管具有数量多、流速快、微循环血容量大、结构紊乱、渗透性高等特点[10-11]。

以上特点构成了肿瘤微循环在时空上不平衡，其中乳腺癌良性肿瘤血管形成相对成熟，其微血管密度略高于正常血管，渗透性明显低于恶性肿瘤。针对以上区别采用T1加权DCE-MRI分析异常肿瘤微循环系统可有效动态监测对比剂在肿瘤微循环中吸收、分布以及代谢消除等药动学过程，通过药动学参数评估定量评估肿瘤血管情况，从而诊断良性、恶性肿瘤。

本次研究结果显示恶性组患者Ktrans、Kep、Ve均显著高于良性组患者(P<0.05)，与窦瑞雪报道一致[12]，乳腺癌患者DCE-MRI定量参数随着肿瘤恶性程度增加而增加。分析认为乳腺癌新生血管迅速增加，引起微循环系统结构紊乱和动静脉瘘的产生，从而造成血管内皮不完整，血管壁薄而脆，管径增粗，血管基底膜减少可升高血管通透性，注射对比剂后可迅速分布，由于恶性程度增加，肿瘤中微循环系统运转更加流畅，故而对比剂分布更加迅速，容量转移、分布速率等相关常数明显增加[13-14]，其中良性病变胶原纤维增生可增加细胞外血管外间隙结构致密性，阻滞对比剂流通，故而表现为良性肿瘤患者定量常数明显小于恶性肿瘤。研究认为当恶性肿瘤患者Ktrans、Kep均明显增加时两者比值(Ve)并未明显增加，故而使得良性、恶性肿瘤患者Ve值重叠影响医师判断[12]。本次研究发现3.0T DCE-MRI诊断乳腺良性、恶性病变的敏感度特异度约为80%，作为单一诊断效能稍显不足，故而在实际临床诊断过程中需配合联合诊断以提高诊断效能。

图4 ROC曲线分析

肿瘤标记物因其特异性已逐步成为早期肿瘤筛查重要指标，例如越来越多研究发现微小RNA(microRNA)参与肿瘤发生与发展且肿瘤基因突变累积，microRNA可在血液系统、实体瘤中检测到其异常表达[15]，如micro RNA21在肺癌、胃癌以及乳腺癌中高表达，通过作用于骨形态发生蛋白通路相关基因、P53等基因促进肿瘤细胞增殖以及抑制细胞凋亡[6]。金属硫蛋白-1E也在乳腺癌中高表达，其外周血表达水平与肿瘤淋巴结转移、分化程度、临床分期等存在相关性。本次研究研究结果显示恶性组患者micro RNA21、金属硫蛋白-1E水平显著高于良性组(P<0.05)，表明随着肿瘤恶性程度的增加，其表达水平存在增加趋势。Pearson相关性分析结果显示Ktrans、Kep、Ve分别与外周血micro RNA21、金属硫蛋白-1E水平具有正相关性(P<0.05)，故而外周血肿瘤标志物水平也可反应肿瘤血管活跃程度。micro RNA21并不是乳腺癌特异性标志物，因此用于乳腺良性、恶性病变判断仍需要结合临床治疗或者其他肿瘤标志物。本次研究以组织病理学检查判断为金标准，ROC曲线分析结果显示外周血micro RNA21、金属硫蛋白-1E诊断恶性病变的AUC(95% CI)为0.872(0.816～0.928)、0.838(0.773～0.902)，均高于0.8，表明具有较好诊断价值。同时，MicroRNA21、金属硫蛋白-1E以及3.0T DCE-MRI联合诊断敏感度(92.5%)、阴性预测率(88.1%)以及准确率(90.4%)均明显高于单独检测，表明联合诊断可显著提高诊断效能。3.0T DCE-MRI定量参数可反映肿瘤新生血管情况，肿瘤恶性病变会诱导内皮细胞产生间质胶原酶、纤溶酶原激活物等，增加毛细血管壁通透性，丰富的血供保证了充分营养物质和氧气，微血管密度明显增加，故而可在一定程度上代替组织学检查[16-17]。结合血清micro RNA21、金属硫蛋白-1E水平，从分子生物学角度解释肿瘤细胞恶性情况，评估肿瘤细胞浸润、转移潜力如淋巴结转移患者、高分化程度患者金属硫蛋白-1E高于未转移者或者低分化患者[18]，三者之间互补性有效降低单一指标造成的漏诊率、误诊率，指导医师诊断乳腺癌患者，对于治疗方案制定以及患者生存质量和远期生存率具有重要临床价值。

综上所述，乳腺癌患者外周血micro RNA21、金属硫蛋白-1E高表达与3.0T DCE-MRI定量参数具有相关性，三者联合检查对于乳腺良恶性病变诊断有重要临床价值。