施用有机肥对生菜和土壤中可培养抗生素耐药菌的影响

李会贤,赵 晶,姚春霞,黄柳娟,冯 博,王 华,王卫国,邵 毅∗

(1上海海洋大学食品学院,上海201306;2上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海201403;3华东师范大学地理科学学院,上海200241;4 上海市设施园艺技术重点实验室,上海201403;5美国俄亥俄州立大学食品科学与技术系,哥伦布43210;6复旦大学生命科学学院,上海200433;7上海国荣果业专业合作社,上海201516)

抗生素在养殖业中的过量应用易引发细菌产生耐药性(AR),会对环境和食品的安全造成严重影响。除了动物源性农产品,研究人员在蔬果产品中也发现了耐药菌(ART)[1-2],但其污染来源尚不明确。 栽培要素中的土壤[3-4]、灌溉水[5]、粪肥[6]∕有机肥[7]、甚至空气[8]中富含的ART 菌和AR基因,都是蔬果表面ART 菌的潜在来源;此外,土壤中的抗生素残留也有可能对蔬菜内生菌造成耐药压力[9]。 揭示种植过程中各栽培要素及种植操作对蔬果产品,特别是对即食蔬果产品中ART 菌的影响,是保证其微生物安全性的基础。

目前,有关农产品中ART 菌的研究主要集中在致病菌的耐药性筛查和耐药机制等方面[10-11]。 但致病菌仅占整个细菌生态系统中的很小一部分,且诸多证据表明,多种非致病菌均可成为AR基因的供体、受体及中间体,对AR基因的水平迁移扩散具有重要作用[12]。 目前,已在蔬果中发现了大量的AR基因移动原件[13],表明蔬果中AR基因水平迁移现象的存在。 因此,亟需在整个细菌生态系统范围内展开研究,以揭示不同栽培要素和操作对蔬果产品中的ART 菌发生的影响。 本研究通过盆栽试验,探究单次施用有机肥对采摘期生菜及其栽培土壤中7 类ART 菌数量以及8 种AR基因存在情况的影响,为揭示鲜食生菜表面耐药菌的污染来源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

1.1.1 生菜栽培、施肥处理及采样

生菜栽培试验在上海普南园艺场进行,周边无大型养殖场。 盆栽试验共设2 个处理组,分别为未施用有机肥组(CK)和施用有机肥组(OMT,Organic manure treated)。 在50 cm(长) × 20 cm(宽) × 20 cm(深)的塑料盆中装4∕5 盆土(5 kg),OMT 组在土壤表面施加当地农资店购买的商品化鸡粪肥200 g(有机肥与土壤的质量比为1∶25),一次性施入并混匀。 大小及叶片数量均一致的生菜苗于施肥当天移植入塑料盆中,苗间距一致,每盆8 棵,每组3 盆。 栽培期间用自来水作为灌溉水源。 栽培0 d、30 d 和45 d 后从每个盆中随机采集干净的生菜叶和根层(土壤表层3—4 cm)土壤样品,于冰盒中存放,并于当天运回实验室进行耐药菌的分离。

1.1.2 市售生菜及处理

市售生菜产品购自上海市大型菜场,采后于冰盒中存放,2 h 内运回实验室,清洗10 min 或浸泡30 min后筛查耐药菌。

1.2 仪器与试剂

1300 SERIES A2 型生物安全柜,美国Thermo Fisher Scientific 公司;SX-500 型高压灭菌锅,日本TOMY公司;BAGMIXER400 型匀浆机,法国Interscience 公司;Medcenter Einrichtungen GmbH 型恒温培养箱,德国Friocell 公司;聚合酶链式反应(PCR)仪和核酸电泳系统,美国Bio-rad 公司;全自动凝胶成像系统,上海复日科技有限公司。

抗生素粉末四环素(Tetracycline,TET)、强力霉素(Doxycycline,DOX)、磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole,SUL)和三甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim,TRI)、头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、红霉素(Erythromycin,ERM)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、萘啶酸(Nalidixic acid, NDA) 购自美国 Sigma 公司; 放线菌酮(Cycloheximide,CYC)购自美国Amresco 公司;脑心浸液肉汤(Brain heart infusion,BHI)琼脂培养基购自英国Oxoid 公司; PCR 试剂购自北京全式金生物技术有限公司;PCR 引物[14]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 可培养耐药菌的筛查和计数

10 g 土壤、生菜或鸡粪肥样品分别与90 mL 0.9%的生理盐水装入无菌袋中,用匀浆机拍打10 min,10 倍梯度依次稀释,每个浓度梯度分别取200 μL 悬浊液均匀涂布于含有16 μg∕mL TET、16 μg∕mL DOX、152 μg∕mL SUL 和8 μg∕mL TRI、4 μg∕mL CTX、100 μg∕mL ERM、4 μg∕mL CIP 或8 μg∕mL NDA 的BHI 培养基平板上[15]。 每个培养基平板内均含有100 μg∕mL CYC 以抑制酵母菌和霉菌的生长。 平板倒置于30 ℃培养箱中,培养48 h 后进行可培养耐药菌的菌落计数。 样品均质液梯度稀释后涂布于不含抗生素仅含CYC 的BHI 平板中,30 ℃培养48 h 后进行可培养总菌的菌落计数。 每个样品重复3 次。

1.3.2 耐药基因的筛查

根据菌落形态,在每个采样点随机挑取至少25 株具有四环素耐药表型或磺胺耐药表型的细菌,用PCR 法筛查8 个耐药基因tetA、tetB、tetC、tetG、tetL、tetM、sul1、sul2 和一类整合酶基因intI[14]。

1.3.3 数据处理

生菜、土壤和有机肥中ART 菌的计数结果及耐药菌占总菌的比例用(平均值±标准误差)表示。 用SPSS 16.0 软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)方法比较处理组与对照组中耐药菌占总菌的百分比的差异显著性,当P＜0.05 时,差异显著。

2 结果与分析

2.1 市售生菜中可培养耐药菌的计数

市售生菜表面普遍存在耐药菌,除未发现强力霉素耐药菌(DOXr)外,对本研究涉及的几种抗生素耐药的细菌均有不同程度检出,甚至在清洗10 min 或浸泡30 min 后的生菜中仍检出一定水平具有耐药表型的细菌(表1)。

表1 市售生菜中可培养总菌和耐药菌数量Table 1 Counts of cultivable total bacteria and ART bacteria in lettuce samples from markets

2.2 有机肥、土壤与生菜苗中可培养耐药菌的本底水平

鸡粪肥中能检出7 种耐药菌,其计数均高于106CFU∕g,比土壤和生菜苗中可培养耐药菌的本底水平高1—6 个数量级。 有机肥中除CTXr和SULr外,其余耐药菌占总菌比例均高于土壤。 土壤和生菜苗中均未发现DOXr,土壤中其他耐药菌的数量和占总菌的比例均高于生菜苗,且耐药菌的数量高于生菜苗0—1 个数量级(表2)。 比较有机肥、土壤与生菜苗中耐药菌的本底水平,推测富含大量耐药菌的有机肥通过直接接触这一途径将更多的耐药菌引入土壤环境,进而在栽培过程中污染生菜产品。

表2 鸡粪肥、土壤和生菜苗中可培养耐药菌本底水平及占可培养总菌的比例Table 2 Background levels and percentages of cultivable antibiotic-resistant bacteria in chicken manure,soil and lettuce samples

2.3 单次施用有机肥对生菜和土壤中可培养耐药菌数量的影响

生菜栽培至第30 天和第45 天,其表面CTXr,SULr,NDAr,CIPr,ERMr5 类耐药菌占总菌的百分比均显著高于未施肥组,达7.88%—100.00%,是对照组的1.15—10.43 倍;TETr和DOXr仅在栽培45 d 样品中检出,其中TETr在对照组和处理组中分别占总菌的0.01%和2.47%,DOXr仅在处理组中发现,占总菌的2.35%[图1(a)]。 因此,不论是耐药菌的种类还是数量,施肥组的生菜均高于对照组,说明单次施用有机肥会提高生菜表面ART 菌的污染水平。 同时,比较未处理组采摘期与0 d 生菜样品表面的ART 菌(表2),发现除SULr、TETr和DOXr外,其他4 类ART 菌占总菌的比例均显著升高,说明除了施肥处理外还有其他因素会导致生菜表面ART 菌的累积。

栽培30 d 和45 d 时,施肥组土壤中可培养耐药菌占总菌的百分比较CK 组有所增加,增加倍数因耐药菌种类不同而不同:30 d 时,TETr、CIPr、NDAr、ERMr和SULr5 种耐药菌占总菌的百分比提高至对照组的5.52 倍、3.98 倍、1.43 倍、1.27 倍、1.2 倍,45 d 时提高至对照组的513.74 倍、15.63 倍、2.35 倍、22.21 倍、2.15 倍;30 d 时,对照组和施肥组的CTXr占总菌的百分比并无差异,而到45 d 时,施肥组中CTXr的百分比略高于不施肥组,是其1.27 倍;30 d 时,两组土壤中均未检出DOXr,但在45 d 施肥组中检出,为1.66 ×102CFU∕g,占总菌的0.48%[图1(b)]。

2.4 单次施用有机肥对生菜和土壤中耐药基因的影响

为了在分子水平进一步确认单次施用有机肥对生菜表面和土壤细菌耐药性的影响,在随机选取的具有耐药表型细菌菌落中筛查了6 个tet基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetL和tetM)、2 个sul基因(sul1 和sul2)和指示基因水平迁移潜势的一类整合酶基因intI的存在情况。 结果表明,有机肥处理组的采摘期生菜和土壤中3 类基因的检出率均高于对照组(图2),表明单次施用有机肥可增加生菜及其栽培土壤中细菌的耐药性和AR基因水平迁移的潜势;苗期生菜未发现3 类耐药相关基因,可能与其四环素和磺胺耐药水平较低(表2),获得的用于基因检测的菌落数(4 个)较少有关;土壤菌落样品中未检出tetA,生菜表面菌落样品中未检出tetC和tetM,与已有报道[16]有所不同,可能与所施用的有机肥中AR基因组成不同有关。

3 讨论与结论

已有研究证实,施用发酵有机肥会增加土壤中AR基因数量[17],施肥可能是耐药微生物及AR基因进入土壤环境的主要途径[18]。 本研究结果表明,处于采摘期的生菜(栽培30 d 或45 d)表面存在大量ART菌,且有机肥施用组的土壤和生菜中筛查到的ART 菌种类和水平以及AR基因的检出率均高于对照组,说明单次施用有机肥不仅提高土壤耐药菌的污染水平,还会影响生菜表面耐药菌的数量和种类,带来环境和食用方面的双重风险,因此应格外重视养殖场用药管理和粪便处理措施,以达到控制和减灭抗生素耐药菌的目的。

研究表明,耐药菌除了在抗生素筛选压下被诱导、选择性富集外,耐药基因还会通过水平基因迁移(HGT)途径进行传播和扩散[12]。 本研究在生菜和土壤样品中均发现了较高水平的intI基因,推测生菜表面ART 菌的富集过程中发生了HGT,但哪类细菌参与了HGT 的发生、相关AR基因是否有可能迁移至人类共生菌中等问题值得深入研究。 此外,生菜、土壤和有机肥中ART 菌的同源性分析及AR基因和移动元件的迁移潜势研究,有助于揭示有机肥施用对生菜AR 菌污染影响的分子机制。