鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)免疫途径研究
2020-10-26张俊平李春华蒋凤英倪建平赵本进杨惠萍
张俊平,李春华,蒋凤英,林 鸷,倪建平,赵本进∗,杨惠萍
(1 上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106;2 上海佳牧生物制品有限公司,上海201403)
鸽Ⅰ型副黏病毒(Pigeon Paramyxovirus Ⅰ,PPMV-Ⅰ)病俗称鸽瘟、鸽新城疫,是由副黏病毒科副黏病毒属的禽Ⅰ型副黏病毒(Avian ParamyxovirusⅠ,APMV-Ⅰ)引起的高度接触性、急性传染病,传播迅速、死亡率高,是目前危害我国养鸽业的主要疫病之一[1-2]。 该病流行期长,鸽群常常突然发病,迅速蔓延,其临床症状与鸡新城疫相似,主要临床特点是肠炎、下痢和神经症状,尤以嗜神经速发型多见[3]。 1981 年,该病首先在苏丹和埃及的信鸽中发现,然后迅速传播到欧洲、加拿大、美国等地[4]。 我国于1985 年首次分离到该病毒,目前全国大多数地区已经有该病的报道[5]。 朱杰等[6]认为,PPMV-Ⅰ是鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的变异株,它不同于典型的NDV,是两个不同宿主的适应株,两个毒株既有共同特性,也有不同之处。 国内外学者花费了大量精力来研究NDV 不同毒株间的鉴定和分类方法,有的根据病毒的生物学特性进行分类,如根据病毒致病性强弱可将NDV 分为强毒株、弱毒株和中等毒力的毒株;有的根据病毒的物理化学特性进行分类,如热稳定性、结构多肽或核苷酸序列的分析[7];也有通过单克隆抗体(mAb)的结合模式对不同毒株进行分类[8]。 我国目前控制PPMV 病大多数采用NDV 疫苗(灭活疫苗、弱毒∕中等毒力活疫苗),虽然PPMV 与NDV 存在非常高的交叉反应,但是在生产实践中证实用NDV 疫苗免疫效果不够理想,常常会出现免疫失败[9]。 目前国内没有针对PPMV 病的特效药,为了有效预防该病,上海佳牧生物制品有限公司研制了鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)。 确定疫苗的临床免疫途径是疫苗研制必不可少的环节,因此,本试验按照兽用生物制品的研究指导原则,通过一系列试验确定鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)的免疫途径,以期为疫苗的使用提供依据。
1 材料与方法
1.1 种毒
鸽副黏病毒Ⅰ型种毒(S-1 株)由上海佳牧生物制品有限公司研发中心科技人员于2009 年在上海郊区某鸽场分离、鉴定和保存[10],病毒血凝价HA:1∶256,鸡胚半数致死量:107.5ELD50∕(0.1 mL),MDT(最小致死量病毒致死鸡胚平均时间):64.8 h,ICPI(1 日龄雏鸡脑内注射的致病指数):1.3625,IVPI(6 周龄雏鸡静脉致病指数):0.75。
1.2 仪器与试剂
立式胶体磨:上海弗鲁克流体机械制造有限公司;水浴锅:国华电器有限公司;电子天平:赛多利斯科学仪器有限公司;灭菌柜:张家港环宇制药设备有限公司;洁净烘箱:上海华东制药设备有限公司。 吐温-80、硬脂酸铝及司本-80 购自国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯;兽用白油:浙江正信石油科技有限公司。
1.3 试验鸽
上海青浦养鸽场提供的30 d 低抗体幼龄鸽(HI 抗体≤2)和120 d 低抗体青年鸽(HI 抗体≤2)。
1.4 疫苗
试验用鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)为上海佳牧生物制品有限公司实验室制品。 病毒液为通过尿囊腔接种SPF 鸡胚收获感染尿囊液获得,病毒含量均在108.0EID50∕(0.1 mL)以上,检验合格的病毒液与兽用白油1∶1乳化获得鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株),并经检验为合格疫苗,疫苗生产批号分别为:160301、160302、160303。 试验在上海佳牧生物制品有限公司实验动物房内进行。
1.5 不同免疫途径免疫低抗体幼龄鸽(30 d)的抗体消长试验
1.5.1 试验鸽分组及免疫
将80 只30 d 的低抗体幼龄鸽随机分为4 组,每组20 只。 其中第1、2、3 组为试验组,每组10 只以颈部皮下注射,另外10 只以胸部肌肉注射,分别接种鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)实验室制品160301批、160302 批和160303 批,免疫剂量为0.2 mL∕只。 第4 组不接种作为对照组。 所有试验鸽在同等条件下隔离饲养,提供优质的饲料和清洁的饮水。
1.5.2 试验鸽观察
免疫后每日观察试验鸽的饮食状况、精神状态、粪便及注射部位是否有异常,记录不良反应情况,待试验结束时比较试验组和对照组试验鸽的体重差异并剖检试验鸽,观察注射部位疫苗吸收情况。
1.5.3 试验鸽抗体检测
免疫后每2 周采血,分离血清,按常规微量法[11]测定试验鸽HI 抗体产生情况,HI 效价判定以完全抑制血凝的最高稀释度为终点,以χlog2 表示,每次均需重复1 次,最后取平均值作为判定结果。 直至免疫后20 周,比较两种不同免疫途径免疫低抗体幼龄鸽产生抗体的差异。
1.6 不同免疫途径免疫低抗体青年鸽(120 d)的抗体消长试验
1.6.1 试验鸽分组及免疫
将80 只120 d 低抗体青年鸽随机分为4 组,每组20 只。 其中第1、2、3 组为试验组,每组10 只以颈部皮下注射,另外10 只以胸部肌肉注射,分别接种鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)实验室制品160301批、160302 批和160303 批,免疫剂量为0.5 mL∕只。 第4 组不接种作为对照组。 所有的试验鸽在同等条件下隔离饲养,提供优质的饲料和清洁的饮水。
1.6.2 试验鸽观察
同1.5.2。
1.6.3 试验鸽抗体检测
同1.5.3。
2 结果与分析
2.1 不同免疫途径免疫低抗体幼龄鸽(30 d)抗体消长情况
用实验室试制的3 批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)分别颈部皮下或胸部肌肉注射免疫30 d 低抗体幼龄鸽,通过对免疫试验鸽的临床观察和抗体水平监测发现:颈部皮下和胸部肌肉注射免疫30 d 低抗体幼龄鸽均无异常反应,精神状况良好,羽毛有光泽,饮食正常,粪便正常,注射部位无明显变化,剖检未见异常,试验组和对照组鸽体重无明显差异,两种免疫途径抗体水平差异不显著,抗体水平自免疫后2周逐渐升高,直至免疫后第8 周达到最高,然后逐渐降低。 具体抗体水平见表1。
表1 不同免疫途径免疫低抗体幼龄鸽抗体消长情况(log2)Table 1 Antibody detection of 30-day-old pigeons with low-HI antibody by different inoculation routes(log2)
2.2 不同免疫途径免疫低抗体青年鸽(120 d)抗体消长情况
用实验室试制的3 批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)分别颈部皮下或胸部肌肉注射免疫120 d 低抗体青年鸽,通过对免疫后试验鸽的临床观察和抗体水平监测发现:颈部皮下和胸部肌肉注射免疫120 d低抗体青年鸽均无异常反应,精神状况良好,羽毛有光泽,饮食正常,粪便正常,注射部位无明显变化,剖检未见异常,试验组和对照组鸽体重无明显差异,两种免疫途径抗体水平差异不显著,抗体水平自免疫后2 周逐渐升高,直至免疫后8—10 周达到最高,然后逐渐降低。 具体抗体水平见表2。
表2 不同免疫途径免疫低抗体青年鸽抗体消长情况(log2)Table 2 Antibody detection of 120-day-old pigeons with low-HI antibody by different inoculation routes(log2)
3 结论与讨论
根据试验结果判定,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)对30 d 低抗体幼龄鸽和120 d 低抗体青年鸽安全,并从第2 周开始抗体水平逐渐升高,直至第8 周左右达到峰值,然后逐渐下降。
试验表明,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)颈部皮下和胸部肌肉两种不同免疫途径免疫30 d 低抗体幼龄鸽、120 d 低抗体青年鸽产生的抗体水平无明显差异。 因此,在鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)制造及检验试行规程中规定:该疫苗的免疫途径为胸部肌肉注射或皮下注射。
在本试验中,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1 株)油佐剂制备使用的白油是国产兽用白油,黏度[运动黏度(40 ℃)]为7.89 mm2∕s,疫苗剂型是油包水单相苗。 两种免疫途径对鸽抗体水平的产生影响差异不大,但是抗体水平达到峰值却需要8—10 周,时间较长。 在试验鸽免疫过程中发现,虽然胸部肌肉和颈部皮下注射免疫试验鸽均无异常反应,但是当注射剂量偏大时(0.5 mL),注射过程稍稍有困难。 因此,可选择更优质的佐剂,例如进口白油、蜂胶、弗氏佐剂、ISA206VG 佐剂等制备鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株),获得更好剂型的疫苗,减少注射时的阻力,让动物体内抗体尽早产生,并且尽可能维持较长时间的较高水平的抗体滴度,从而减少疫苗注射过程可能对鸽造成的应激反应。