草菇液体菌种培养基配方及培养条件的优化

余昌霞,李正鹏,赵 妍,查 磊,汪 虹,杨焕玲,陈明杰,郭 倩

(上海市农业科学院食用菌研究所,农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,国家食用菌加工技术研发中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海201403)

随着食用菌工厂化的发展,食用菌液体菌种在工厂化生产中已被广泛应用。 液体菌种因其具有生长迅速、菌龄整齐、制种简便、使用方便、接种点多、萌发和现蕾快、周期短等优点,受到工厂化生产的青睐,同时可降低生产成本,提高产品质量,经济效益显著[1-2]。 目前,液体菌种已在金针菇[3-4]、杏鲍菇[5]、蟹味菇[6]等工厂化企业广泛应用,香菇液体菌种[7]也在逐步普及。

草菇是最具中国特色的食用菌品种之一,具有较高的市场知名度,售价一直居高不下[8],其生物学特性也显示了它是最佳的工厂化栽培品种之一。 目前,草菇产业将逐步往工厂化、标准化、规模化和智能化的方向发展。 多年来,草菇生产中仍采用固体制种方式[9],常规的固体菌种是采用棉籽壳菌种,经过原种、栽培种等复杂的生产环节,以及装瓶、掏瓶、装袋、灭菌、接种等繁琐的程序,存在生产周期长、菌龄不一致、操作不便等缺点。 由于草菇生物学效率较低,因此需要在其制种技术和栽培技术方面进行改进。为适应新形势下的草菇产业大规模发展,草菇液体菌种用于草菇工厂化栽培是发展的趋势之一。 本研究通过正交试验分别对草菇液体菌种培养基配方、培养条件进行优化,为草菇液体菌种应用于工厂化栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

草菇(V.volvacea)‘9715’菌株由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供。

1.2 培养基

固体培养基:PDA 培养基为美国BD 公司生产的合成培养基,称取39 g 加水定容至1 L,用于试管和平板培养菌丝。

碳源筛选培养基(g∕L):碳源20,蛋白胨1,磷酸二氢钾2,硫酸镁0.5,供试碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、海藻糖。

氮源筛选培养基(g∕L):氮源2,葡萄糖20,磷酸二氢钾2,硫酸镁0.5,供试氮源为蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、硫酸铵、硝酸钾。培养条件优化培养基(g∕L):葡萄糖25,酵母浸粉4,磷酸二氢钾1,硫酸镁1。以上所有培养基均在121 ℃下灭菌15 min。

1.3 碳、氮源的筛选

将保存的菌种活化,即转接至PDA 平板,32 ℃恒温培养3 d 可得母种。 然后将活化的母种用打孔器打孔,取一定量的菌块经均质仪打碎后,接入2%(以15 mm2菌块计为1%的菌种接种量)的菌液于装有100 mL 筛选培养基的250 mL 三角瓶中,置于32 ℃、转速150 r∕min 摇床上振荡培养5 d,收集菌丝测定菌丝生物量,每处理5 个重复。

1.4 液体菌种配方优化

根据碳、氮源的单因素筛选试验结果,分别选取较好的碳源、氮源及KH2PO4和MgSO4,设计L9(34)正交试验,对草菇液体菌种的培养基配方进行优化,试验因素及水平如表1 所示。 接种方法及培养条件同1.3,通过测定菌丝生物量确定培养基的最佳配方。

表1 最佳配方L9(34)正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the L9(34)orthogonal experiment g·L -1

1.5 液体菌种培养条件的确定

经正交试验筛选出草菇液体菌种培养的最佳配方后,再对适宜配方的培养条件进行优化。 分别选取接种量、液体装瓶量、温度和转速,采用L9(34)正交表确定液体菌种的最佳培养条件,试验因素及水平如表2 所示,通过测定菌丝生物量确定培养基的最佳配方。

表2 最佳培养条件L9(34)正交试验因素水平Table 2 Factors and levels of the L9(34)orthogonal experiment

1.6 生物量测定

用无纺布过滤培养结束的液体培养基中的菌丝,再用蒸馏水冲洗2—3 次,收集菌丝在烘箱中(60 ℃)烘干至恒重,用电子分析天平称其干重。

1.7 数据分析

测得的数据采用SPSS 19.0 进行分析。

2 结果与分析

2.1 草菇液体菌种培养基配方的确定

2.1.1 不同碳源对草菇菌丝生长的影响

碳源是构成细胞和代谢产物中碳架来源的营养物质,也是生长繁殖的能量来源,为食用菌菌丝生长提供重要的营养。 由表3 可知,草菇菌丝在5 种碳源中均能生长,但以葡萄糖为碳源时,菌丝生物量达到最高,并显著高于其他碳源,表明葡萄糖可作为‘草菇9715’菌株液体菌种的最适碳源。

表3 不同碳源对草菇菌丝生长的影响Table 3 Effect of different carbon source on the mycelial growth of V.volvacea g

2.1.2 不同氮源对草菇菌丝生长的影响

氮源是食用菌细胞合成蛋白质和核酸的主要原料,在深层发酵中起着重要作用。 由表4 可知,‘草菇9715’在酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨中均能很好的生长,而在硝酸钾和硫酸铵中生长较差,表明草菇利用无机氮的效果不佳,其中以酵母浸粉为氮源时,菌丝生物量最大,极显著优于其他氮源,表明酵母浸粉可作为‘草菇9715’菌株液体菌种的最适氮源。

表4 不同氮源对草菇菌丝生长的影响Table 4 Effect of different nitrogen source on the mycelial growth of V.volvacea g

表5 最佳配方L9(34)正交试验设计及结果Table 5 Results of the L9(34)orthogonal experiment of optimal cultivation medium

2.1.3 最佳配方的确定

根据单因子试验结果,选择最适碳源和氮源及KH2PO4和MgSO4作为基本因子,进行L9(34)正交试验,结果如表5 所示。 不同处理之间菌丝生物量有一定差异,由极差分析结果可以看出,RA＞RB＞RD＞RC,极差越大起的作用越大,4 个因素中对菌丝生物量的影响大小依次为:葡萄糖(A) ＞酵母浸粉(B) ＞MgSO4(D) ＞KH2PO4(C),其中MgSO4和KH2PO4的影响较小。 根据方差分析结果(表6),葡萄糖对菌丝生物量的影响最为显著。 在试验设计范围内,优化得到的最佳配方为A3B3C1D2,这与正交试验表中出现的最大值组合A2B3C1D2不一致,经验证,以组合A3B3C1D2培养的草菇液体每100 mL 菌种菌丝体干重达到(0.507 9 ±0.022 9)g,优于A2B3C1D2,即适合‘草菇9715’菌株液体培养的最佳培养基配方为:葡萄糖25 g∕L,酵母浸粉4 g∕L,KH2PO41 g∕L,MgSO41 g∕L。

表6 配方正交试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment result of cultivation medium

2.2 草菇液体菌种培养条件的确定

根据2.1 中优化得到的培养基组合作为基本培养基,选择液体装瓶量等作为基本因子,进行L9(34)正交试验,结果如表7。 不同处理菌丝生物量有一定差异,由极差分析结果可以看出,RD＞RC＞RA＞RB,4个因素对草菇液体菌种菌丝生物量的影响依次为:转速(D) ＞温度(C) ＞接种量(A) ＞装液量(B)。 通过方差分析,四因素中,转速和温度的影响较为显著,其中转速的作用最为显著(表8)。 在试验设计范围内,优化得到的最佳培养条件为A2B3C1D2,即接种量2%,装瓶量120 mL,温度32 ℃,转速125 r∕min。

表7 最佳培养条件L9(34)正交试验设计及结果Table 7 Results of the L9(34)orthogonal experiment of optimal culture conditions

表8 培养条件正交试验结果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment result of culture conditions

3 结论与讨论

草菇液体菌种生长的影响因素较多,如生长所需的营养物质、培养温度、接种量等。 液体菌种培养基的优化对菌丝生长产生重要的影响,特别是碳、氮源的种类及浓度的选择优化。 任海霞等[10]研究表明,液体培养条件下,适宜草菇菌丝生长的最佳碳源是淀粉,最佳氮源是蛋白胨,最佳碳氮比是10∶1,最佳淀粉浓度是3.0%,草菇菌丝生长的最适温度为30 ℃,最适pH 为7.0。 张萍等[11]研究了不同碳源、氮源及无机盐对‘草菇V110’液体培养菌丝生长的影响,结果表明草菇液体培养较适宜的碳源是蔗糖,氮源是蛋白胨、酵母膏和牛肉膏,无机盐是KH2PO4。 杜姝莲等[12]研究表明,‘草菇V238’菌株液体菌种较适宜的葡萄糖浓度为1%—1.5%,最佳生长温度为33 ℃,转速为200 r∕min,接种量为5%。 本研究通过单因素筛选试验,以菌丝生物量作为评价指标[13-14],确定了‘草菇9715’液体菌种最适碳源为葡萄糖,最适氮源为酵母浸粉。 结果表明,草菇菌丝既可以利用单糖也可以利用双糖物质的碳源,且葡萄糖的效果较好,可能是因为小分子碳源可被直接吸收利用,在培养前期可使菌种快速定植,而大分子的碳源需要通过菌丝体分泌的胞外酶水解为葡萄糖后才被利用。 以酵母浸粉为氮源,因其是酵母细胞经过破壁之后的水提取,其营养成分更加丰富而更利于菌丝生长所需。

正交试验在研究多因素多水平的试验中具有高效、快速等优点,是目前常用的优化培养基的方法之一。 本试验进一步通过正交试验,对适合‘草菇9715’菌丝生长的液体培养基配方及培养条件进行了优化,经试验得到‘草菇9715’液体菌种的最佳配方为葡萄糖25 g∕L,酵母浸粉4 g∕L,KH2PO41 g∕L,MgSO41 g∕L;最佳培养条件为接种量2%,装瓶量120 mL,温度32 ℃,转速125 r∕min,此时草菇液体每100 mL 菌种的菌丝生物量可达(0.602 2 ±0.084 7)g。 本研究结果与前人研究结果有相似之处,也有不同之处,其原因可能是试验选用的菌种不同或培养基的物料配比差异导致的。 本研究可为草菇工厂化液体菌种的应用提供科学依据,并加快草菇工厂化栽培的进程。