福建梅花山圈养华南虎幼虎与成年虎肠道菌群结构的比较研究

孙艳发 张 敏 陈腾腾 傅文源* 许卫华 吴 琼李 焰 朱雨婷 张雪梅 刘灵宇 陈东虹 林开雄* 林炜明*

(1.龙岩学院生命科学学院，龙岩，364012；2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，龙岩，364012；3.预防兽医学与生物技术福建省高校重点实验室，龙岩，364012；4.福建梅花山华南虎繁育研究所，上杭，364201)

动物肠道菌群含有数以万亿计的微生物细胞，形成复杂动态变化的微生物群落[1]。建立一个复杂稳定的菌群对宿主的生长发育至关重要[2-3]。动物出生后，微生物便在胃肠道内开始定植，帮助宿主营养消化，刺激免疫和肠道发育成熟，竞争性地排斥病原体[4]。在人工条件饲养的东北虎(Pantheratigrisaltaica)中，在门水平上，肠道中变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinomycota)和梭菌门(Clostridium)4种为主要肠道菌群；在属水平上，大肠杆菌属(Escherichia)、柯林斯菌属(Collinobacteria)和梭菌属(Fusobacterium)最为丰富；在种水平上，圈养的东北虎肠道菌群中，大肠杆菌(Escherichiacoli)、溃疡梭菌(Clostridiumulcerans)和变种梭菌(Clostridiummutans)的丰度最高[5]。宿主食物的选择也影响动物肠道菌群的结构组成，两者互惠共生[6]。羊奶喂养的东北虎幼仔比母乳喂养的东北虎幼仔肠道内有益菌较少，致病菌较多，微生物多样性也较高[7]。驱虫药芬苯达唑片和伊维菌素片能够破坏东北虎的肠道菌群，改变了其代谢的稳态[8]。此外，饲养人员肠道微生物的组成，生活的地理位置，食物种类等也影响虎肠道微生物群落的组成[9]。

华南虎(Pantheratigrisamoyensis)也称中国虎、厦门虎，我国独有的虎亚种。华南虎曾是世界分布最为广泛的虎亚种，现在却已基本认定野外绝迹[10]。为找到华南虎野外存活的证据，并对其种群进行系统恢复，2000年9月出台了“拯救华南虎行动计划”，系统开展华南虎的人工繁育、野外种群调查、栖息地恢复、人工种群重引入等工程[10]。在人工繁育方面，人工圈养华南虎已达100余只，分散在全国十几家动物园等养殖单位[11]。在人工圈养条件下，由于个别母虎母性不好或初胎华南虎哺育幼仔经验的缺乏，常因弃仔导致华南虎幼虎存活率偏低[12]。通过人工育幼技术的发展和幼虎人工乳的开发显著提高了华南虎幼虎存活率，为扩大华南虎种群数量提供了技术保障[12-14]。动物肠道菌群组成与宿主的健康密切相关，华南虎幼虎常因肠道内菌群失衡，特别是一些致病菌的侵害造成其死亡[15]。因此，本研究通过对华南虎幼虎与成年虎肠道菌群多样性与差异的研究，探索健康华南虎幼虎与成年虎肠道优势菌群与显著差异菌群，为华南虎食物选择特别是幼虎人工乳的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本试验所用华南虎粪便样品由福建梅花山华南虎繁育研究所工作人员采集。其中2018年8月采集3只2月龄左右华南虎幼虎粪便新鲜样品各1份，样本编号为M99.3，M101.3和M102.3；2019年3月采集5只10岁左右的华南虎成年虎粪便新鲜样品各1份，样本编号为M83，M29，M36，M55和M61。共计8份样本于-80 ℃保存备用。

1.2 肠道细菌DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethylammonium bromide，CTAB)法提取华南虎肠道样品基因组DNA(gDNA)。由赛默飞世尔科技公司的NanoDropTMOne测定华南虎肠道菌群gDNA浓度和质量，使用灭菌蒸馏水稀释浓度至1 ng/μL。

1.3 肠道细菌16S rRNA基因的扩增、文库制备与测序

利用引物528F(GCGGTAATTCCAGCTCCAA)和706R(AATCCRAGAATTTCACCTCT)扩增16S rRNA基因V4区域。30 μL PCR反应体系包括上下游引物各0.2 μm、10 ng模板DNA和15 μL新英格兰生物学实验室的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix。PCR反应条件为：98 ℃条件下1 min预变性，30个循环包括98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物与1×相同体积含有SYBR的加样缓冲液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。采用赛默飞世尔科技公司Gene JETTM胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。

采用赛默飞世尔科技公司的Ion Plus Fragment Library Kit制备测序文库。由赛默飞世尔科技公司的Qubit®2.0荧光计评估文库质量。文库质量合格后由Ion S5TMXL测序平台进行400 bp单末端测序。

1.4 测序数据的处理与分析

去除原始数据的接头、引物和嵌合体序列得到有效序列。将具有高度相似性(97%)的有效序列聚类成为OTU(operational taxonomic units)。基于OUT结果，利用QIIME V1.7.0软件进行华南虎肠道微生物Alpha多样性分析。本研究中分析7个Alpha 多样性指数，包括ACE指数、Chao1指数、goods coverage指数、observed species指数、Shannon指数、Simpson指数和PD whole tree指数。这些指数的高低可反映华南虎肠道样品群落内的复杂度大小。同时进行华南虎幼虎和老年虎肠道微生物Alpha多样性指数显著性检验，找到物种多样性显著增高或降低的分组。

Beta多样性分析可以评价华南虎幼虎和成年虎肠道样品间的微生物群落结构差异。使用Jaccard样本间物种距离计算方法计算样本间距离，获得距离矩阵，进行Wilcox秩和检验。使用QIIME V 1.7.0软件计算华南虎幼虎和老年虎肠道样品微生物间Unifrac值，得到微生物的群落结构差异程度。使用RV 2.15.3软件进行主成分分析(principal component analysis，PCA)分析展示华南虎幼虎和老年虎肠道样品间微生物群落结构二维的差异。为了寻找各分类水平下组间的差异物种，进行华南虎幼虎和成年虎肠道微生物丰度组间t-test检验，鉴定差异显著(P<0.05)的物种。使用QIIME V1.7.0软件进行华南虎幼虎和老年虎肠道样品微生物非加权组平均聚类分析(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA，)分析以及Beta多样性指数组间差异分析，鉴定华南虎幼虎和老年虎肠道样品间微生物的差异。使用LEfSe(LDA effect size)分析华南虎幼虎与成年虎肠道菌群间差异显著的物种。

2 结果与分析

2.1 样品中的OTU数目与物种丰度

本研究共计对8只华南虎肠道样本进行16S rRNA测序，基于相似度大于97%的原则，去除noblasthit和unknown结果共获得501个OTUs，分布于17个门(phylum)、28个纲(class)、58个目(order)、104个科(family)、176个属(genus)和109个种(species)。所有粪便样品共有72个的OTUs(图1)。

图1 OTUs韦恩图Fig.1 Venn diagram of OTUs

根据物种注释结果，选取各组门和属水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，查看各组样品在不同分类水平上相对丰度较高的物种及其比例。由图2可知，在门水平上，华南虎幼虎和成年虎肠道微生物主要由厚壁菌门(75.31%和75.11%)、粪便变形菌门(Proteobacteria，16.92%和16.43%)、放线菌门(Actinobacteria，2.90%和3.48%)以及梭杆菌门(Fusobacteria，0.27%和8.57%)等组成，其中华南虎幼虎肠道变形菌门细菌丰度高于成年虎，梭杆菌门细菌含量低于成年虎。在属水平上，华南虎幼虎与成年虎肠道细菌丰度差异较大，幼虎肠道细菌主要由巨单胞菌属(Megamonas，45.42%)、链球菌属(Streptococcus，15.32%)、肠杆菌科某属(Enterobacteriaceae，7.18%)、乳酸菌属(Lactobacillus，7.05%)以及毛螺菌科某属(Lachnospiraceae，5.12%)等细菌组成。成年虎肠道细菌主要由梭菌属(33.13%)、布劳特氏菌属(Blautia，8.73%)、艰难梭菌属(Peptoclostridium，8.73%)、梭杆菌属(Fusobacterium，8.56%)、Paeniclostridium属(3.95%)以及肠杆菌属(1.02%)等组成。

图2 华南虎幼虎(m)和成年虎(y)粪便微生物在门(A)和属(B)水平上物种相对丰度柱形图Fig.2 A histogram of species differences at the phylum(A)and genus(B)levels of fecal bacteria between cub(m)and adult(y)tigers

表1 华南虎幼虎和成年虎肠道微生物多样性指数

2.2 Alpha多样性分析

通过Alpha 多样性分析进行华南虎幼虎和成年虎肠道微生物的丰富度和多样性进行比较。华南虎幼虎和成年虎肠道微生物Alpha多样性指数见表1。Shannon指数和Simpson指数用于衡量样本的多样性，其中Shannon指数为2.857—4.734，Simpson指数为0.704—0.936。Chao1指数和ACE指数反应样本物种的丰度，M101.3样本的Chao1指数和ACE指数较小，分别为168.345，181.498。PD whole tree指数反应了样品中物种对进化历史保存的差异，各样本差异较小。所有样品的覆盖度(goods coverage)大于99.99%，说明本研究中文库的大小足以代表大多数细菌。指数组间差异检验(t-test)表明，华南虎幼虎和成年虎肠道微生物Alpha多样性差异不显著(P=0.717 6，图3)。

图3 华南虎幼虎和成年虎肠道微生物Alpha多样性Fig.3 The Alpha diversity of fecal microbiota between cub and adult tigers

2.3 Beta多样性分析

2.3.1 Beta指数组间差异分析

Beta多样性通过微生物群落构成的比较，评估微生物群落间的差异。Wilcox秩和检验分析结果表明，华南虎幼虎粪便样品物种Beta多样性显著高于成年虎(P=0.048 9，图4)。

图4 华南虎幼虎(m)和成年虎(y)肠道微生物Beta多样性Fig.4 The Beta diversity of fecal microbiota between cub(m)and adult tigers(y)

2.3.2 主成分分析

主成分分析(principal component analysis，PCA)能够将多维数据的差异反映在二维坐标图上。如果样品的群落组成越相似，则它们在PCA图中的距离越接近。由图5可知，华南虎幼虎和成年虎肠道微生物能够明显分为两组，说明年龄相近的华南虎肠道微生物的组成相似。其中PC1和PC2分别解释了31.2%和23.38%粪便微生物的组成。

2.3.3 组间t-test检验

华南虎幼虎和成年虎肠道微生物丰度组间t-test检验结果见图6。由图6可知，在纲、目、科和属水平上，成年虎肠道梭菌纲(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、梭菌科(Clostridiales)和梭菌属(Clostridiales)微生物丰度均显著高于幼年华南虎(P=0.001，0.001，0.03和0.03)。此外，成年虎肠道消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、Lachnoclostridium属细菌丰度也显著高于幼年华南虎(P=0.008，0.035)。

图5 华南虎幼虎(m)和成年虎(y)肠道微生物主成分分析Fig.5 The principal component analysis of fecal microbiota between cub(m)and adult tigers(y)

2.3.4 基于LefSe(LDA effect size)分析华南虎幼虎与成年虎肠道菌群间的物种差异

LEfSe分析华南虎幼虎与成年虎肠道菌群间差异显著的物种结果见图7。其中LDA值分布柱状图(图7A)显示华南虎幼虎与成年虎粪便微生物之间具有显著差异的微生物类群(LDA score >4)。在幼虎粪便微生物具有显著丰度差异的物种有：Gaiellales目、鲁氏不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)、Solirubrobacterales目、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、约翰不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。在成年虎粪便微生物具有显著丰度差异的物种有：梭状芽胞杆菌纲、梭菌目、梭菌科、梭菌属、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、Blautia属、梭杆菌目(Fusobacteriales)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、梭杆菌属(Fusobacterium)、梭杆菌门(Fusobacteria)、死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)、Paeniclostridium属、漫游球菌属(Vagococcus)和托伊贝尔漫游球菌(Vagococcusteuberi)。进化分支图(6B)由内至外辐射的圆圈，显示了华南虎幼虎与成年虎在门至种属水平的分类群相对丰度差异。每个不同分类的小圆圈表示一个分类单元，而每个圆圈的直径的大小反映了相对丰度的高低。由图7可知，LDA 值分布柱状图与进化分支图的结果相近。

图6 华南虎幼虎(m)和成年虎(y)肠道微生物丰度在纲(A)、目(B)、科(C)和属(D)水平上组间t检验Fig.6 The t-test of fecal microbiota abundance at class(A)，order(B)，family(C)and genus(D)levels between cub(m)and adult tigers(y)

图7 华南虎幼虎(m)和成年虎(y)肠道微生物LDA值分布柱状图(A)和进化分支图(B)Fig.7 Distribution histogram based on LDA value(A)and evolutionary branch graph(B)of fecal microbiota between cub(m)and adult tigers(y)

3 讨论

动物出生后，肠道菌群随着哺乳、采食等逐渐在胃肠道内定植，经过生长繁殖逐渐形成优势菌群[16]。这些在肠道内定植的菌群与宿主相互作用，对宿主的营养物质代谢和免疫系统的发展至关重要[4]。本研究通过对华南虎幼虎和成年虎肠道菌群进行16S rRNA V4基因进行测序，探索华南虎幼虎和成年虎肠道菌群组成和差异。本研究发现，华南虎幼虎和成年虎肠道菌群主要来自4个门，包括厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和梭杆菌门，这与东北虎肠道中优势菌群一致[6，17]。华南虎幼虎肠道中变形菌门的细菌丰度高于成年虎，这个门下的细菌主要包括大肠杆菌、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)、粪嗜冷杆菌(Psychrobacterfaecalis)等多中致病菌。华南虎幼虎肠道致较高的病菌丰度，可能是其高死亡率的原因之一。华南虎幼虎肠道中的梭菌在纲、目、科、属水平上的丰度均显著低于华南虎成年虎。梭菌属于厚壁菌门是肠道内一大类正常的、能产生芽孢的兼性厌氧细菌，包含有益的梭菌和有害的梭菌两类[18]。由于梭杆菌门细菌多为消化道细菌，华南虎幼虎消化系统发育未完善，这可能是定植于消化道内的梭杆菌门细菌丰度较低的原因。

主成分分析表明根据肠道菌群的组成可明显区分华南虎幼虎与成年虎。幼虎肠道细菌差异显著的物种，如乳酸杆菌科、属与双歧杆菌科、目、属细菌。华南虎幼虎肠道中乳酸菌、双歧杆菌这些有益菌的含量较高，可以维持肠道酸性环境，竞争性地排除病原体，有利于幼龄虎对乳汁、人工乳和肉糜的消化吸收[19]。成年虎肠道细菌差异显著的物种主要是梭菌纲、目、科属的细菌，这一结果与华南虎幼虎与成年虎肠道菌群差异分析结果基本一致。

华南虎数量稀少，通过增加母乳喂养的频率或者提供高品质的人工乳，可改善幼虎的肠道菌群结构，提高幼虎的成活率。本研究通过16S rRNA测序评估华南虎幼虎与成年虎肠道菌群的组成和差异。华南虎幼虎和成年虎肠道菌群主要来自厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和梭杆菌门4个门。华南虎幼虎肠道菌群的Beta多样性显著高于成年虎，群落组成更加复杂。华南虎幼虎与成年虎肠道菌群存在差异显著的物种。这些发现揭示了华南虎幼虎与成年虎肠道菌群的组成和差异，为人工饲养条件下华南虎的饲喂以及幼虎人工乳的研制提供了理论基础。