闽楠叶斑病化学杀菌剂与抑菌植物室内筛选

陈全助，叶小真，吴 松，江仲鹏，郑婉铮，龚 辉，宋 漳

(1.福建农林大学金山学院，福建 福州 350002； 2.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；3.南平市建阳区林业局，福建 南平 354200)

闽楠(Phoebebournei)为樟科(Lauraceae)楠属(Phoebe)乔木，主要分布于亚热带常绿阔叶林，其木材结构细腻、纹理美观、芳香耐腐，是我国特有珍稀用材树种、国家二级保护濒危植物，也是福建省珍贵优良乡土用材树种[1-4]，在国家木材战略储备中占有重要地位。闽楠干形通直优美，枝叶雅致清秀，生态功能显著，是重要的庭院观赏和城市绿化树种[1，5]。闽楠叶斑病(Pestalotiopsismicrospora)是近年来楠木大面积推广种植过程中苗木培育基地和幼龄林分新发现的叶部病害，造成叶面斑枯，影响植株正常生长[2]，同时带病苗木也成了病害扩散的传染源。当前有关闽楠叶斑病防治的研究鲜有报道，本研究拟通过高效低毒杀菌剂、植物浸提物对闽楠叶斑病菌进行室内毒力测定筛选，旨在为闽楠叶斑病害防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2019年，带有叶斑病病原小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株的闽楠病组织样品采自漳州南靖，带回福建农林大学森林保护研究所实验室分离鉴定，作为药剂筛选供试菌株。

1.2 供试化学杀菌剂

1.3 供试抑菌植物及其使用部位

大青(Foliumisatidis)、香樟(Cinnamomumcamphora)、银杏(Ginkgobiloba)、艾叶(Artemisiaargyi)的供试部位为叶片；苦楝(Meliaazedarach)、黄柏(Phellodendronchinense)的供试部位为树皮；苦参(Sophoraflavescens)、北豆根(Menispermumdauricum)、远志(Polygalatenuifolia)的供试部位为根；知母(Anemarrhenaasphodeloides)、黄连(Coptischinensis)的供试部位为根茎；连翘(Forsythiasuspensa)的供试部位为果实。

1.4 化学杀菌剂室内毒力测定

1.4.1 病原菌丝对化学杀菌剂敏感性测定 药物毒力测定采用含毒介质培养菌丝生长速率抑制法[6-7]。药剂配制采用外比法[7-8]，制成系列浓度梯度含药均匀的PDA培养基平板，以不含药PDA培养基作对照。各杀菌剂带药质量浓度：世高、百菌清、异菌·氟啶胺、大生、克菌丹为20.00、10.00、6.70、5.00、3.30 μg·mL-1，多·锰锌为2.00、1.30、1.00、0.80、0.67 μg·mL-1，曹氏甲托为0.20、0.13、0.10、0.08、0.067 μg·mL-1，恶霉灵为50.00、33.00、25.00、20.00、17.00 μg·mL-1。取直径5 mm供试菌株菌饼，接种各处理PDA培养基，每处理各重复5次，置(28±1) ℃恒温培养5 d后，采用“十字交叉法”测定菌落直径，计算相对抑制率[8-9]。

1.4.2 孢子萌发对化学杀菌剂敏感性测定 敏感性测定采用分生孢子萌发抑制法[10]。病原分生孢子配制成带药质量浓度分别为20.00、10.00、6.70、5.00、3.30 μg·mL-1、孢子质量为2.5×105孢子·mL-1的悬浮液后，吸取30 μL滴加于带同样药剂浓度的PDA培养基载玻片，涂抹均匀，以不含药剂作对照，3次重复，置培养皿内保湿，(28±1) ℃恒温培养6 h，待孢子萌发后随机抽取5个视野约100个分生孢子，统计孢子萌发率，计算抑制率。

1.5 植物源浸提物抑菌效果测定

称取烘干、粉碎、过40目筛的供试植物粉末30 g，置500 mL锥形瓶中，加75%乙醇溶液200 mL，80 ℃水浴锅恒温浸提6 h后真空抽滤，滤渣用等量75%乙醇溶液继续浸提6 h后再次过滤，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩至膏状，4 ℃保存备用。植物提取物菌丝抑菌试验方法同1.4.1，取直径5 mm菌饼接种由浸提物和PDA培养基配制而成的质量浓度为0.1 mg·mL-1的带药培养基，(28±1) ℃恒温培养5 d后采用“十字交叉法”测定菌落直径，统计各浸提物对菌丝生长的抑制率，以不含浸提物作对照，每处理各重复5次。分生孢子萌发对浸提物敏感性测定方法同1.4.2，吸取含药质量浓度0.1 mg·mL-1、孢子浓度2.5×105孢子·mL-1悬浮液30 μL，均匀涂抹含同样浸提物浓度的PDA培养基载玻片，(28±1) ℃恒温培养5 h，孢子萌发后随机抽取5个视野约100个分生孢子，统计孢子萌发率，计算抑制率。

1.6 数据分析

参照于静亚等[9]的方法，采用IBM SPSS Statistics 21软件对测定数据进行统计分析。以各处理药剂浓度对数值为自变量(x)，相应处理对病原菌丝和分生孢子抑制机率值为因变量(y)，拟合毒力回归方程。根据方程得出各杀菌剂的抑菌中浓度EC50，EC50值越小表明药剂毒力作用越大，故以EC50比较不同药剂对该病原毒力作用的强弱。

2 结果与分析

2.1 化学杀菌剂对病原菌丝生长的影响

由表1、图1可知，供试的8种化学杀菌剂对闽楠叶斑病病原小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株菌丝生长均具有抑制效果，但不同药剂之间的EC50值相差各异，药剂间的抑制效果存在差异。从毒力回归方程和EC50值的大小可以看出，供试药剂中对菌丝生长抑制效果最好的是曹氏甲托、多·锰锌，EC50值分别是0.115、0.718μg·mL-1，均小于1 μg·mL-1；其次是百菌清、世高、异菌·氟啶胺，EC50值分别是3.160、3.717、4.420 μg·mL-1，介于1～5 μg·mL-1之间；再次是大生，EC50值为9.609 μg·mL-1；抑菌效果较差的是恶霉灵、克菌丹，EC50值分别是25.400、29.813 μg·mL-1。

表1 供试杀菌剂对小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株菌丝生长的抑制效果

A为曹氏甲托；B为多·锰锌；C为百菌清；D为世高；E为异菌·氟啶胺图1 不同化学杀菌剂对小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株菌丝生长的抑制效果

2.2 化学杀菌剂对病原分生孢子萌发的影响

由表2可知，8种杀菌剂对病原菌小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌发抑制效果差异不一，不同药剂间EC50值差异性相对较大。供试药剂中，抑制效果最好的是异菌·氟啶胺、曹氏甲托、多·锰锌，EC50值分别为2.291、3.419、4.809 μg·mL-1，介于1～5 μg·mL-1之间；其次是百菌清，EC50值为8.113 μg·mL-1；再次是克菌丹、恶霉灵、世高，EC50值分别为15.852、17.005、18.849 μg·mL-1，介于15～20 μg·mL-1之间；抑制效果最差的是大生，EC50值48.063 μg·mL-1。

表2 供试杀菌剂对小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌发的抑制效果

2.3 植物提取物对病原菌菌丝生长的影响

不同大写字母为差异极显著(P<0.01)，下同。 图2 12种植物提取物对小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株菌丝生长的抑制率

由图2、图3可知，供试的12种植物浸提物对闽楠叶斑病原小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株菌丝生长的影响各异，除银杏、香樟、大青浸提物对病原菌丝生长有促进作用外，其它植物浸提物对病原菌丝生长则均有抑制作用，各植物浸提物对病原菌株菌丝生长的影响差异极显著(P<0.01)。具有抑制效果的植物浸提物中，以知母浸提物抑制效果最显著，平均抑制率高达92.52%；其次是远志、黄连，抑制率分别为75.93%、70.14%；再次是黄柏，抑制率为57.59%；其它植物浸提物的抑制率则相对较低。

图3 植物提取物对小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株菌丝生长的抑制效果

2.4 植物提取物对病原分生孢子萌发的影响

由图4可知，供试植物浸提物对闽楠叶斑病原小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌发的影响各异，除香樟、苦楝、银杏和北豆根4种浸提物没有抑制效果外，其它植物浸提物对分生孢子萌发均具有明显抑制效果。其中以黄连、连翘浸提物抑制率极显著高于其它植物浸提物(P<0.01)；其次是苦参浸提物，黄连、连翘、苦参3种植物浸提物的抑制率均超过50%；再次是黄柏，抑制率为43.67%；抑制效果较差的是大青、知母、艾叶、远志等植物浸提物，抑制率介于10%～30%。

图4 植物提取物对小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌发的抑制效果

3 结论与讨论

小孢拟盘多毛孢系拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌，是闽楠叶斑病[2]、石楠(Photiniaserrulata)叶斑病[9]、澳洲坚果(Macadamiaspp.)叶枯病[11]、油茶(Camelliaoleifera)叶枯病[12]、美国红枫(Acerrubrum)褐斑病[13]的致病菌。关于小孢拟盘多毛孢病菌防治药剂筛选，于静亚等[9]认为咪鲜胺、甲基托布津和苯醚甲环唑对石楠叶斑病菌的抑制效果较佳；蒋桂芝等[11]认为多菌灵、戊唑醇和烯唑醇等药剂对澳洲坚果叶枯病菌菌丝生长抑制效果最好；阳廷密等[14]认为咪鲜胺、代森锰锌、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯等药剂能够有效抑制柑橘黄斑落叶病菌菌丝生长，而咪鲜胺、嘧菌酯、苯醚甲环唑、乙蒜素和吡唑醚菌等药剂均能有效抑制其孢子萌发。本研究通过菌丝生长抑制法和分生孢子萌发抑制法分别测定了世高、百菌清、异菌·氟啶胺、大生、克菌丹、多·锰锌、曹氏甲托和恶霉灵等8种药剂对闽楠叶斑病菌小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株的抑制作用，结果表明，供试杀菌剂中，以曹氏甲托、多·锰锌对菌丝生长的抑制效果最好，异菌·氟啶胺、曹氏甲托、多·锰锌对分生孢子萌发的抑制效果较好，其中曹氏甲托和多·锰锌2种杀菌剂表现出同时对病原菌丝和分生孢子具有较好的抑制效果，但异菌·氟啶胺对分生孢子的抑制效果较曹氏甲托和多·锰锌强，后续将对室内筛选的药剂进行田间防治试验，以便田间推广使用。此外，当前闽楠枝枯病等病害在福建省普遍严重发生，在开展叶斑病野外防治试验的同时可兼顾调查分析所筛药剂对这些病害的抑制效果。曹氏甲托对闽楠叶斑病菌小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株菌丝的抑制效果与于静亚等[9]测定的结果一致，表明曹氏甲托对小孢拟盘多毛孢具有良好的抑制效果。与单型剂大生(80%代森锰锌)相比，多·锰锌表现出较强的抑菌效果可能与该药剂为多菌灵和代森锰锌混配剂型有关，抑制效果的增强是否与多菌灵有关有待进一步深入研究分析。

尽管化学杀菌剂在植物病害防治过程中成效显著，但化学杀菌剂易污染环境，病原容易产生抗药性和耐药性等问题，因此探寻环境友好型、不易产生抗、耐药性植物源农药将成为今后植物病害防治的发展趋势。植物浸提物因具有高效、低毒和低残留等优点，成为时下新型无公害杀菌剂研究开发的热点[15-16]。本试验以知母、远志、黄连、黄柏和连翘等12种植物提取物对闽楠叶斑病菌小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株进行抑菌活性室内筛选，结果发现知母浸提物对病原菌丝生长的抑制效果显著，而黄连和连翘浸提物则能有效抑制病原分生孢子萌发。知母、黄连和连翘是传统中药材，具有潜在抑菌活性，是天然的生物源抑菌剂。前人研究结果表明，知母对马铃薯晚疫病菌[17]、黄连对松材线虫[18]，以及连翘对芒果大茎点霉(Macrophomamangiferae)和拟茎点霉(Phomposismangiferae)[19]表现出抑制作用。鉴于此，知母、黄连和连翘可作为抑制闽楠叶斑病菌小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株植物源生物农药，具有潜在开发应用研究价值，后续工作有待对该植物源抑菌剂的抑菌活性物质及其结构和抑菌机理进行进一步深入研究。