下调HOTA I R 通过提高P T EN表达逆转HCC827细胞吉非替尼耐药

翟阳 陈茜 王玉珍 李旭 李丽娜

肺癌的发病率和死亡率均居全球及中国恶性肿瘤中的首位，其中约80%以上为非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）[1]，目前分子靶向治疗已成为NSCLC治疗的主要手段之一，其中以吉非替尼（Gefitinib）为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factot receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）具有突出的成效，但晚期NSCLC患者一线使用Gefitinib靶向治疗的中位疾病无进展生存时间（progression-free survival, PFS）仅为9.6个月[2]，因此，探索EGFR-TKIs耐药机制、寻找逆转耐药的途径成为了亟待解决的问题。

长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）是长度超过200 nt的一类非编码内源性RNA，定位于细胞质及细胞核，因lncRNA缺乏明显的开放阅读框而不能编码蛋白质，但却能够通过转录、转录后及表观遗传学水平对肿瘤细胞的生物学特性进行调控[3-5]。HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）定位于人类染色体12q13.13，长度为2,364bp，既往研究[6-8]表明，HOTAIR异常表达于多种肿瘤细胞，能够通过双向结合多梳蛋白抑制复合体2（polycomb repressive complex 2, PRC2）和赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1, LSD1）修饰靶基因组蛋白并使下游基因沉默，同时能够促进上皮-间质化过程并能同肿瘤抑制因子及微小RNA（microRNAs, miRNAs）相互作用，从而调控肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡，并参与肿瘤的发生与发展。

既往研究[9]发现，HOTAIR在NSCLC患者组织中呈高表达，且参与了NSCLC的发生发展及侵袭转移的过程。Zhang等[10]研究发现HOTAIR能够通过激活PI3K/Akt信号通路与第10号染色体缺失的张力蛋白同源的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN）结合，从而促进子宫内膜癌细胞增殖。Li等[11]发现在人喉部鳞癌中，HOTAIR可诱导PTEN的甲基化和下调，导致PI3K/AKT通路活性增加，从而促进肿瘤的增殖和转移。Chen等[12]在乳腺癌中也得出了一致的结果。提示我们HOTAIR能够通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路发挥调控肿瘤的作用。

本研究采用质体转染法将体外合成的针对HOTAIR的siRNA转染HCC827GR入细胞中，通过生物信息学预测HOTAIR的靶基因，并应用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）及Western blot方法检测HOTAIR及PTEN、PI3K、AKT的表达水平，同时采用MTT法检测各组细胞的吉非替尼半抑制浓度（50%inhibitory concentration, IC50），运用流式细胞术分析各组细胞凋亡率及生长周期的变化。从体外实验证明下调HOTAIR表达可以通过调控PTEN/PI3K/AKT通路，抑制HCC827细胞增殖，促进其凋亡，并可以逆转HCC827GR细胞对吉非替尼的耐药，下调HOTAIR表达可能成为逆转NSCLC患者EGFR-TKIs耐药的新策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料 收集2019年1月-2020年1月陕西省肿瘤医院确诊的NSCLC患者外周血血清7例，其中吉非替尼治疗有效患者4例，耐药患者3例，男性3例，女性4例，平均年龄（65.7±10.3）岁。人肺癌HCC827细胞株及HCCC827吉非替尼耐药细胞株（HCC827GR）由西安交通大学生物医学中心实验室保存，HCC827GR细胞为前期参考Fumiaki等[13]在文献中提供的方法通过低浓度吉非替尼持续诱导HCC827细胞构建。用CCK-8法检测该细胞对吉非替尼的敏感性，计算IC50在20 μmol/L左右，并且在不加药培养基培养的条件下，相关耐药表型稳定至少6个月，即为构建成功。

1.2 细胞培养 使用RPMI-1640培养基加20%胎牛血清（FBS）和100 U/mL的双抗（均购自美国Hyclone公司），孵箱条件为37 °C，5%CO2，饱和湿度的培养箱中（购自美FOR-MA公司），0.25%胰酶+0.02% EDTA（购自美国Sigma公司）消化、传代。实验选用对数生长期的细胞。

1.3 生物信息 学分析利用Targetscan数据库（http://www.targetscan.org）及Starbase数据库（http://starbase.sysu.edu.cn）预测HOTAIR及PTEN的潜在相关结合位点。

1.4 siRNA转染 按实验需要分为6组：HCC827组、HCC827GR组、HCC827GR/HOTAIR-NC组、HCC827GR/si-HOTAIR组、HCC827GR/HOTAIR-NC+gefitinib组及HCC827GR/si-HOTAIR+gefitinib组。si-HOTAIR序列为5’-UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3’，阴性对照（negative control, NC）序列为 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’（由上海吉玛制药技术有限公司合成) ，转染前1天将（4-5）×104细胞接种在24孔板上，培养于37 °C、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。第二天将稀释好的siRNA和lipofectaminTM2000（购自美国Invitrogen公司）试剂混匀形成siRNA/lipofectamin复合物，100 μL siRNA/Lipofectamin复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，放入CO2培养箱中37 °C温育24 h-48 h。

1.5 RT-qPCR 检测HOTAIR、PTEN表达HOTAIR引物上游：5’-TAGGCAAATGTCAGAGGGTT-3’，下游：5’-ACACAAGTAGCAGGGAAAGG-3’；PTEN引物上游：5’-CTATTCCCAGTCAGAGGCGCTAT-3’；下游：5’-TGAACTTGTCTTCCCGTCGTGT-3’；GAPDH: 上游：5’-ATTGATGGAT GCTAFGAGTATT-3’，下游：5’-AGTCTTCTGGGTGGCA GTGA T-3’（由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成）。结果判读：扩增完毕后行溶解曲线分析，以GAPDH为内参，采用公式：采用公式：2-ΔΔCq［ΔΔCq = Cq（target gene）- Cq（GAPDH）］计算各指标的mRNA相对表达量。以上步骤重复3次。

1.6 Western blot 检测各组细胞PTEN、PI3K、AKT蛋白表达选择生长良好的细胞，加入蛋白裂解液提取蛋白并采用BCA法定量（BCA蛋白定量试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司），取30 μg蛋白，加入等体积2×loading buffer，煮沸5 min。配制10% SDS-PAGE胶，将凝胶玻璃固定于电泳装置上，加入电泳缓冲液，将样品短暂离心，用微量上样器吸取适量样品，缓慢加入蛋白Marker及样品，之后在外槽中加入适量电泳缓冲液; 电泳、转膜、封闭后加入封闭液稀释好的一抗c-MET及β-actin（稀释比为1:2,000），密封条件下于4 °C 冰箱过夜。洗膜后加入封闭液稀释好的二抗（稀释比为 1:2,000），室温下于摇床上温和摇动2 h。洗膜、发光，ECL显影5 min。采用图像采集系统对X线片结果进行扫描取图，利用Image J 软件对所摄图片进行灰度值分析及比较。各组样品目的蛋白与相应内参的灰度值比值为其最终统计分析数据。每组重复3次。

1.7 MTT法检测细胞的药物敏感性 将HCC827GR细胞用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接种于96孔板，置于37 °C、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h，每孔中加入不同浓度梯度的吉非替尼，各浓度设5孔，并设调零孔（只有培养液）和对照孔（培养基+药物溶解剂+细胞）。分别培养24 h、48 h、72 h后：每孔加入灭菌的5mg/mL MTT（美国Sigma公司）20 μL，继续培养4 h，弃去培养液，加入DMSO液（美国Sigma公司）150 μL/孔，水平振荡10 min使紫蓝色结晶物充分溶解后置于高通量多功能微板测试（492 nm）测定各孔光吸收值（以A表示），以空白孔调零，取4孔平均值，计算出细胞抑制率IR=（1-A/A0）×100%［A：各药物浓度组光吸收值；A0：未加药物组（对照组) 光吸收值］。

1.8 细胞凋亡率检测 采用Annexin V-PE/7-AAD双染法，应用流式细胞仪检测（购自美国BD公司）HCC827GR细胞凋亡率的变化。取对数生长期细胞，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接种于6孔板，培养至对数生长期。再使用 0.25%胰酶（不含EDTA）消化细胞，进行细胞计数，使每个样品约（0.5-1）×106个/mL细胞，加入结合缓冲液500 μL，重悬细胞；室温、避光条件下加入7-AAD染液5 μL（陕西先锋生物科技有限公司) ，室温避光孵育5 min-15 min，再加入Binding buffer 450 μL，混匀，使抗体与细胞充分结合，加入1 μL Annexin V-PE染液，孵育15min，1h内上机检测。

1.9 细胞周期检测 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接种于6孔板，培养至对数生长期。再次使用常规胰酶消化法制成单细胞悬液; 用含3%小牛血清的70%乙醇固定，4 °C保存过夜；取冷存的细胞，1,000 r/min×8 min离心，去上清；PBS洗涤2次；加入150 μL RNase（5 g/L）（美国Sigma公司）和150 μL PI 溶液（50 μg/mL）（美国Sigma公司）于室温避光染色30 min；使用流式细胞仪检测，分析G0期/G1期、 S期、G2期/M期细胞百分比。

1.10Kaplan-MeierPlotter生存分析 从TCGA数据库（http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga）中下载肺腺癌患者的临床数据。利用肺腺癌患者的生存时间以及状态数据结合HOTAIR及PTEN基因的表达情况，通过R软件“survminer”包中的surv_cutpoint函数选择最佳的cut-off值并进行Kaplan-Meier生存分析HOTAIR及PTEN基因表达与总生存期（overall survival, OS）的相关性。

1.11 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。HOTAIR及PTEN表达与肺腺癌预后的关系采用Kaplan-Meier模型分析及Log-rank检验法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOTAIR在HCC827GR耐药细胞中表达增高 RT-qPCR结果显示HOTAIR在HCC827GR耐药细胞中表达增高（P＜0.01，图1），提示HOTAIR可能参与介导吉非替尼耐药。

图 1 HOTAIR在HCC827GR耐药细胞中表达增高。Fig 1 The expression of HOTAIR increased in HCC827GR cells. **P＜0.01

2.2 下调HOTAIR后HCC827GR细胞中HOTAIR表达降低 RT-qPCR结果显示，HCC827GR/HOTAIR-NC组与HCC827GR组相比无统计学差异，HCC827GR/si-HOTAIR组与HCC827GR/HOTAIR-NC组相比，转染后HCC827GR细胞中HOTAIR mRNA的表达水平下降（70.16±0.57）%，有显著差异（P＜0.01，图2）。结果提示si-HOTAIR 转染可显著降低细胞中内源表达的HOTAIR。

2.3 下调HOTAIR逆转HCC827GR细胞对吉非替尼的耐药 MTT检测结果显示吉非替尼对转染前后HCC827GR细胞杀伤作用均随时间及浓度递增，转染后HCC827GR细胞48 h的IC50为（3.15±0.08）μmol/L，较转染前（18.14±0.17）μmol/L明显降低（P＜0.01，图3）。

2.4 下调HOTAIR可提高HCC827GR细胞PTEN表达、降低PI3K及AKT表达 RT-qPCR及Western blot法检测分析结果均显示，与HCC827细胞组相比，HCC827GR细胞中PTEN表达水平降低，PI3K及AKT水平升高（P＜0.05）。下调HOTAIR后的HCC827GR细胞，相对于阴性对照组，细胞中PTEN的表达水平升高，而PI3K及AKT的表达则较前下降，有显著差异（P＜0.01，图4）。

2.5 下调HOTAIR对HCC827GR细胞凋亡及周期的影响 我们用流式细胞仪技术对HCC827细胞、下调HOTAIR后的HCC827GR细胞以及吉非替尼处理过的HCC827GR细胞进行了细胞凋亡的检测。其中将Annexin V阳性7AAD阴性的细胞为凋亡早期细胞，Annexin V和7AAD双阳性的细胞为凋亡晚期或坏死细胞。分析前上机细胞均进行了细胞计数，凋亡细胞参数设为1万。结果显示，与HCC827细胞相比，HCC827GR细胞凋亡率升高，转染组的HCC827GR细胞凋亡率较空白对照组升高（P＜0.05），吉非替尼联合转染组的HCC827GR细胞凋亡率较单药吉非替尼处理组明显升高（P＜0.05，图5）。HCC827GR细胞中G0期/G1期细胞的含量较低，S期细胞含量较高，而下调 HOTAIR能提高细胞周期中G0期/G1期细胞的含量，与阴性对照组相比，能够抑制HCC827GR细胞从G0期/G1期向S期转变，发生G0期/G1期细胞周期阻滞（P＜0.05，图6）。

2.6 吉非替尼耐药后NSCLC患者血清HOTAIR表达水平升高 RT-qPCR结果显示吉非替尼耐药后NSCLC患者血清中HOTAIR的表达水平明显高于吉非替尼治疗有效的NSCLC患者（P＜0.05，图7）。

2.7 PTEN及HOTAIR表达与肺腺癌患者的生存的相关性Kaplan-MeierPlotter生存分析结果表明肺腺癌患者的OS与PTEN表达呈正相关，而与HOTAIR表达则呈负相关（P＜0.05，图8）。

3 讨论

吉非替尼是首个口服的EGFR-TKIs，2008年IPASS研究结果[14]显示，在腺癌、不吸烟或已戒烟的轻度吸烟者的亚裔晚期NSCLC患者的一线治疗中，与紫杉醇联合卡铂全身化疗相比，吉非替尼组的PFS显著优于化疗组，两组OS无显著差异。NEJGSG002研究[15]证实了IPASS的结果，并提出对于EGFR突变阳性的NSCLC患者，吉非替尼一线治疗优于标准方案化疗。然而在临床中，存在EGFR突变的NSCLC患者吉非替尼的有效维持时间也仅为8个月-10个月，且多数患者容易出现复发，提示此类药物存在较严重的获得性耐药。

虽然大部分的的EGFR-TKIs获得性耐药可用T790M突变及c-MET癌基因的扩增解释，但仍有约30%患者的耐药原因尚不明确[16]。HCC827是EGFR基因19del突变且对吉非替尼敏感的人NSCLC细胞株，我们的前期研究不仅成功构建了吉非替尼耐药细胞株HCC827GR，并且发现PTEN基因与肺癌发生发展有着密切的联系，下调PTEN表达可以诱导肺腺癌HCC827细胞对EGFR-TKIs耐药[17]，另有研究[18]显示在NSCLC中，PTEN作为ATK通路上游重要的抑癌基因，可阻止ATK通路的活化，从而阻断ATK调控的下游信号转导，PTEN可能是通过激活PI3K/AKT而减少具有EGFR突变的细胞的凋亡，提示PTEN缺失可能是导致非小细胞肺癌患者对EGFR-TKIs发生耐药的原因之一，但其具体分子机制仍尚不明确。

图 2 下调HOTAIR后HCC827GR细胞中HOTAIR表达降低。Fig 2 The expression of HOTAIR decreased in HCC827GR cells after down-regulation of HOTAIR. ***P＜0.001; NS: no significant.

图 3 下调HOTAIR逆转HCC827GR细胞对吉非替尼的耐药Fig 3 Down-regulation of HOTAIR increased the sensitivity of HCC827GR cells to gefitinib. IC50: 50% inhibitory concentration.

图 4 下调HOTAIR可提高HCC827GR细胞PTEN表达，降低PI3K及AKT表达Fig 4 Down-regulation of HOTAIR can increase the expression of PTEN in HCC827GR cells,and decrease the expression of PI3K and AKT.

近年来新的研究发现，lncRNA可以发挥癌基因及抑癌基因的作用，能够调控基因转录、转录后和表观遗传水平，与调节染色体的蛋白不同，lncRNA发挥作用不必入核，多以顺式调节方式发挥作用。由于lncRNA可以来源于增强子，故其也有增强子样的作用，同时lncRNA在胞浆参与调节mRNA，并可通过表观遗传学调控改变细胞结构和功能状态[19]。大量研究[20-22]表明多种lncRNA参与了肺癌的发生发展，并与肺癌患者的预后及对化疗药物的耐药有密切的关系。HOTAIR是第一个被发现的反义转录lncRNA，可通过招募PRC2使相应组蛋白发生甲基化，进而调控有关侵袭转移基因的表达进而参与癌症的进展[6-7,23]。Nakagawa等[24]发现NSCLC患者肿瘤组织中HOTAIR的表达水平与肿瘤的大小、分化程度及分期呈正相关。我们的研究发现HOTAIR在HCC827GR耐药细胞及吉非替尼耐药患者血清中表达均增高，同时我们还发现下调HOTAIR后，HCC827GR细胞的增殖能力下降，凋亡率升高，并可引起G0期/G1期细胞周期阻滞，同时能够使HCC827GR细胞恢复对吉非替尼的敏感性，提示HOTAIR可能参与介导了NSCLC的吉非替尼耐药。既往已有多项研究提示HOTAIR在子宫内膜癌、喉部鳞癌及乳腺癌中可通过靶向调控PTEN/PI3K/AKT通路促进肿瘤的增殖和转移。Ma等[25]发现HOTAIR能够和miR-130a结合，通过下调miR-130a导致PTEN等基因下调，进而激活AKT信号通路影响肿瘤的恶性表型。我们通过生物信息学分析预测到HOTARI可作为一种竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）与miR-526b-3p、miR-519d-3p及miR106b-5p相互作用，形成ceRNA的竞争机制，而PTEN为miR-526b-3p、miR-519d-3p及miR106b-5p的下游靶基因，提示高表达HOTAIR可导致miRNA对PTEN的抑制力减弱，这与既往多项研究结果不符，考虑因数据库纳入样本量不足及疾病种类不同而此造成偏差。在本研究中，我们也发现下调HOTAIR后，HCC827GR细胞中PTEN表达升高，而PI3K及AKT的表达则较前下降，同时我们从TCGA数据库中下载肺腺癌患者的临床数据，通过生存分析发现肺腺癌患者总生存与PTEN表达呈正相关，而与HOTAIR表达则呈负相关，这与我们的实验研究结果相一致。因此我们推测，HOTAIR可调节PTEN/PI3K/AKT信号通路，通过负反馈作用于PTEN，调控肿瘤细胞的增殖及凋亡，下调HOTAIR表达可以逆转HCC827GR细胞对吉非替尼的耐药。

图 5 下调HOTAIR促进HCC827GR细胞凋亡Fig 5 Down-regulation of HOTAIR promotes the apoptosis of HCC827GR. *P＜0.05

图 6 下调HOTAIR抑制HCC827GR细胞增殖（P＜0.05）Fig 6 Down-regulation of HOTAIR decreases the cell proliferation ability of HCC827GR (P＜0.05)

本研究首次证明了HOTAIR与HCC827细胞对吉非替尼耐药之间的关系及其机制，提示HOTAIR的表达可有助于判断NSCLC患者对EGFR-TKIs类药物的治疗反应，并为NSCLC靶向治疗耐药后的选择提供了新的方向。

图 7 吉非替尼耐药的NSCLC患者血清中HOTAIR表达升高（P＜0.05）Fig 7 The expression of HOTAIR increased in the serum of NSCLC patients with gefitinib resis-tance (P＜0.05)

图 8 PTEN(A)及HOTAIR(B)表达与肺腺癌患者的生存的相关性Fig 8 Correlation between the expression of PTEN(A) or HOTAIR(B) and the survival of patients with lung adenocarcinoma

Author contributions

Zhai Y, Li LN and Chen Q conceived and designed the study. Zhai Y and Chen Q performed the experiments. Wang YZ and Li X analyzed the data. Zhai Y and Li LN contributed analysis tools. Zhai Y, Li LN and Chen Q provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.