一起致泻性大肠埃希菌食物中毒的病原学检测分析
2020-10-23王银平吴莹刘军张群淄博市疾病预防控制中心
□ 王银平 吴莹 刘军 张群 淄博市疾病预防控制中心
食源性疾病是指人体因摄食有毒有害物质（包括生物性病原体）等致病因子所引发的疾病，无论是在发达国家还是发展中国家其都是目前最为突出的公共卫生问题之一[1]。2020年6月，山东省淄博市某学校发生一起疑似食物中毒事件—6月29日～7月2日，该校陆续有30余人出现呕吐、恶心、腹痛、腹泻（多为水样便，3～6次/天）等消化系统症状。经流行病学调查发现，发病患者均曾在该校食堂就餐，共同暴露食品为西红柿炒鸡蛋、炸虾、稀饭等，除一名患者为食堂内部工作人员外，其余均为学生，且共同进餐人数约200人。本实验采用全自动医用PCR分析系统对采集样本混合样进行22种常见胃肠道感染相关病原体快速诊断，结果判定为致泻大肠埃希菌，然后利用实时荧光PCR技术对所有样本进行致泻大肠埃希菌初筛检验，同时进行样本中致泻大肠埃希菌的增菌培养、分离鉴定。结果证实，导致本次食物中毒事件的病原体是携带毒力基因escV和内参基因uidA的EPEC。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及标本来源
本次事件共采集样本35份，其中，患者粪便23份、肛拭子7份、可疑食物3份（炸虾、肉夹馍、西红柿炒鸡蛋）、熟食刀和熟食砧板涂抹物各1份。将被采集样本装入无菌采样容器后进行编号，然后立即送至市疾控实验室进行病原微生物检验。质控菌株为聚集性大肠埃希菌（EAEC）CMCC24186、产毒性大肠埃希菌（ETEC）CMCC10667、致病性大肠埃细菌（EPEC）CMCC24189、侵袭性大肠埃希菌（EIEC）CMCC10662、出血性大肠埃希菌（EHEC）CMCC24187，均由山东省疾病预防控制中心提供。
1.1.2 主要仪器
FilmArray全自动医用PCR分析系统，法国梅里埃诊断产品（上海）有限公司；ABI QuantStudio 5实时荧光PCR仪，美国ABI公司。
1.1.3 主要试剂
胃肠道感染检测试条（FilmArray G1 Panel），法国梅里埃诊断产品（上海）有限公司；5种致泻性大肠杆菌核酸检测预分装试剂盒（荧光PCR法），深圳生科原生物股份有限公司；营养肉汤、EE肉汤、麦康凯琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基等，北京陆桥有限公司，以上试剂均在有效期内使用。
1.2 方法
1.2.1 全自动医用PCR分析检测
按照胃肠道感染检测试条（FilmArray G1 Panel）操作说明对被采集样本混合样预处理后，进行22种常见胃肠道感染相关病原体的快速诊断。
1.2.2 实时荧光定量PCR检测
按照5种致泻性大肠杆菌核酸检测预分装试剂盒（荧光PCR法）操作说明，应用ABI QuantStudio 5实时荧光PCR仪对35份样本进行5种致泻大肠埃希菌12种特异性基因检测。
1.2.3 致泻性大肠埃希菌的分离培养
依据《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》（GB/T 4789.6-2016）和《山东省食源性疾病主动监测工作手册》（2020年版），对所采集样本进行致泻大肠埃希菌的增菌、分离和鉴定（肛拭子和粪便不增菌，直接进行分离和鉴定）。
表2 实时荧光定量PCR检测通道及检测基因
2 结果
2.1 全自动医用PCR分析系统检测结果
使用全自动医用PCR分析系统对所有样本的混合样进行22种常见胃肠道感染相关病原体检测，结果为检出致泻大肠埃希菌，具体型别为致病性大肠埃希菌（EPEC），详见表1。
2.2 实时荧光定量PCR检测结果
选 择 FAM、HEX/VIC/JOE、ROX、CY5这 4个 荧光通道分别对A/B/C管反应液进行荧光采集（见表2），记录Ct值。样本检测结果判定：Ct值≤35，有明显指数增长，为阳性；Ct值在35～38范围，需对其重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围，且有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性；Ct值＞38或无Ct值，判定为阴性。参照表3对35份样本的Ct值进行判读，最终判定结果为10份样本（2份肛拭子、8份粪便）初筛EPEC阳性，见表4。
2.3 致泻性大肠埃希菌的分离培养
依据全自动医用PCR分析检测结果和实时荧光定量PCR初筛检测结果，明确引起本次疑似食物中毒事件的病原菌为EPEC。对采集样本进行增菌培养后（肛拭子和粪便不增菌，直接进行分离和鉴定），划线至麦康凯琼脂培养基继续培养24h，挑取玫红色可疑菌落划线至脑心浸液琼脂培养基，培养得到菌株纯培养物。然后，再次应用实时荧光PCR技术对获得的菌株纯培养物进行5种致泻性大肠埃希菌的12种特异性基因复核鉴定，最终从6份粪便标本中分离出携带毒力基因escV和内参基因uidA的EPEC菌株。
3 讨论
致泻性大肠埃希菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）是一类能够引起人体以腹泻为主要症状的大肠埃希菌，其可通过污染食物引起人体患病。根据毒力因子、致病机理和流行病学特征可将DEC分为5类，即侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、产毒性大肠埃希菌（ETEC）、致病性大肠埃希菌（EPEC）、出血性大肠埃希菌（EHEC）和聚集性大肠埃希菌（EAEC）。有文献资料显示，近年来，国内已多次出现由致泻性大肠埃希菌引起的食物中毒事件[2-5]。
表3 5种致泻性大肠埃希菌实时荧光定量PCR结果判读
表4 疑似食物中毒35份样本致泻性大肠埃希菌检测结果
学校作为一个特殊的公共场所，人员较为密集且流动性大，一旦疏忽了对食品安全的日常监管，放松了对食堂工作人员食品安全责任意识的培养，极易引起食源性疾病的暴发与流行。在此次食物中毒事件中，由于采集的样本数量有限等原因，未能从食物样本和刀板涂抹物样本中检出病原菌。值得注意的是，本次事件中有一名患者是该学校食堂内部的工作人员，其发病时间比其他学生患者早2～3天，且该患者肛拭子样本经PCR初筛为EPEC阳性，由此推断病原菌EPEC可能是食堂工作人员污染了食物，再经污染的食物感染了多名学生。
本次事件中，35份样本经实时荧光PCR检测初筛EPEC阳性共10份，经增菌培养分离，最终从6份样本中分离出EPEC菌株，其余4份PCR初筛阳性样本未分离到目标菌株。究其缘由，可能是因为PCR技术灵敏度较传统方法高，而肛拭子、粪便等样本中背景菌群庞大、对目标菌的分离存在干扰；同时，患者服用药物也会影响目标菌的存活量及存活状态，这些因素都对目标病原菌的培养分离产生较大影响。与传统的病原菌分离培养方法相比，多重PCR技术和实时荧光PCR技术可以对疑似食物中毒事件的病原体进行快速定性，并减少后续工作量。
邓艳华对食品和公共场所从业人员致泻性大肠埃希菌携带情况的一项研究[6]表明，在所有受检人员中，致泻性大肠埃希菌的检出率明显高于沙门氏菌、志贺菌的检出率。由此可见，在食品从业人员的预防性健康体检项目中，增加致泻性大肠埃希菌的检测具有一定的可行性和必要性。
实验室快速、精准的现代化检测技术在此次食物中毒事件的处置应对中发挥了至关重要的作用，为控制病情赢得了宝贵时间，患者发病后得到了及时的对症治疗，病情得以好转，没有造成严重的后果。食品和公共场所从业人员需提高安全责任意识，采购时选用新鲜食材，加工时做到生熟分开，及时消毒，并严格控制环境温度、湿度等条件，抑制病原菌繁殖，以有效预防食物中毒事件的发生，更好地保障人民群众舌尖上的安全。
