新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测技术平台的研究进展

盛 楠 马雪萍 逄淑云 宋沁馨,2 邹秉杰*,3 周国华*,3,4

1(东部战区总医院药理科， 南京210002) 2(药物质量与安全预警教育部重点实验室， 中国药科大学， 南京 210009) 3(南京大学生命分析化学国家重点实验室， 南京 210093) 4(南方医科大学第一临床医学院， 南京210002)

1 引 言

自2019年12月底出现不明原因引发的聚集性肺炎感染事件以来[1～3]，新型冠状病毒迅速蔓延全球。据世界卫生组织统计，截至2020年5月1日，新型冠状病毒感染人数超过300万，疫情已影响215个国家和地区[4]，对全球人类的健康与生活造成了极大的威胁。

新型冠状病毒是一种RNA正链病毒，与SARS-CoV序列相似性达79.6%[5]，2020年2月11日，国际病毒学分类委员会暂将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，由其引发的疾病统称为COVID-19(Coronavirus disease 2019)[6]。尽管感染SARS-CoV-2的患者也会出现与SARS-CoV和MERS-CoV感染类似的临床症状，如发热、干咳、呼吸困难和双侧磨玻璃密度影等，且病毒潜伏期长，存在无症状感染者[7]， 但不同的是，多数SARS-CoV-2感染患者上呼吸道症状并不明显[8]。此外，SARS-CoV-2表面的S蛋白与人受体血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合力远高于SARS-CoV[9]，这为SARS-CoV-2传染性强于SARS-CoV提供了分子基础。正是由于多方面因素的影响，疫情早期的发现及防控工作中存在巨大困难，最终出现了SARS-CoV-2感染人数呈指数增长的局面。

在缺乏特效药物并且疫苗尚未问世的情况下，准确快速地甄别出SARS-CoV-2感染者， 并对其实施隔离是目前疫情防控的最有效手段[10]。核酸检测在此次疫情防控中起到了至关重要的作用，尤其对于无症状感染者的确诊和康复期患者的出院评判，SARS-CoV-2核酸检测成为了主要标准[11]。因此，发展方便、快速、准确的SARS-CoV-2核酸检测方法对疫情防控尤其重要。

从疫情爆发至今，已开发出多种SARS-CoV-2核酸检测方法，这些方法原理各异，利用的检测平台不同，有各自的优缺点与适用范围。本文将根据检测平台对现有的SARS-CoV-2核酸检测技术进行介绍和比较，为临床选择合适的SARS-CoV-2核酸检测技术提供参考，并对今后建立更安全、更准确、更快速的病原体核酸检测技术平台提出了展望。

2 基于不同平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

2.1 基于高通量测序平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

DNA高通量测序技术凭借其直接测定基因组序列、通量高等优势，近年来成为核酸检测的重要工具，涌现出很多测序平台，如454焦磷酸测序[12]、Solexa测序[13]等第二代测序平台，以及SMRT测序[14]、纳米孔测序[15]等第三代测序平台。这些平台在疾病诊断[16]、微生物群落分析[17]、病原体鉴定[18]等方面应用广泛。此次疫情中的病原体也是通过第二代测序平台转录组测序(图1)分析患者肺泡灌洗液样本所发现。测序结果经序列比对显示，SARS-CoV-2与SL-CoVZC45病毒的序列一致性达89.1%[19]。得益于高通量测序技术，研究人员在疫情初期获得样本的第一时间进行测序， 获取了SARS-CoV-2的完整序列信息，为后续建立快速检测方法提供了基础。

图1 转录组测序原理(SBS测序法)Fig.1 Principle of transcriptome sequencing (SBS sequencing)SBS, sequencing by synthesis

因此，高通量测序平台最大的优势在于可发现未知病原体，并获得未知病原体的基因全序列，非常适用于疫情爆发初期病原体的甄别，并为进一步开发病原体核酸检测方法提供序列信息。此外，采用高通量测序技术还能实时跟踪病原体核酸的变异情况，这在病原体溯源、疫苗开发、疾病流行趋势的预判等方面具有重要作用。

然而，高通量测序平台在进行病原体检测时，常因其仪器价格高、检测周期长、检测成本高等问题而难以推广应用。与其它测序平台相比，纳米孔测序技术读长更长，可进行RNA的直接测序，从测序到出结果的时间可由数天缩减至数小时，并能实时输出测序结果，仪器设备小巧，因此, 在病原体检测方面具有一定优势。近期，武汉大学刘天罡教授等组建的联合团队开发了利用MinION纳米孔测序平台建立的靶向多重呼吸道病原体检测方法[20]，可在6～10 h内对包括SARS-CoV-2在内的多种呼吸道病毒进行检测。随着测序技术的不断进步，相信会有更快、更简便、更准确的测序技术问世， 进一步推动测序平台在病原体检测方面的应用。尽管纳米孔测序技术已将高通量测序的单次运行成本由数万元降至不足1万元，但对于临床应用而言检测成本仍然较高，因此，目前的测序平台难以实现低成本快速检测SARS-CoV-2，未能在此次疫情防控中广泛使用，但在SARS-CoV-2变异、溯源与机制研究中依然具有不可替代的地位。

2.2 基于实时荧光PCR平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

与高通量测序平台相比，实时荧光PCR平台凭借一台小巧的实时荧光定量PCR仪，即可实现对已知序列靶标核酸的高灵敏定量检测，因其稳定可靠、操作简便，成为目前应用最广的核酸检测平台。疫情爆发的第一时间，各大科研机构和公司根据SARS-CoV-2基因序列研制了基于实时荧光PCR平台的SARS-CoV-2核酸检测方法与试剂盒。这些方法多基于荧光标记探针对扩增的靶核酸进行检测，其基本原理(图2)是通过逆转录酶将病毒由RNA序列反转录为DNA序列，再进行PCR扩增过程; 在PCR扩增过程中，当带有荧光标记的靶标特异性Taqman探针与靶标序列杂交时，标记的荧光基团会被DNA聚合酶的核酸外切酶活性切割，产生荧光信号，每个循环的荧光信号被仪器记录下来，形成扩增曲线，根据CT值可对待测靶标进行定量检测[21]。目前，基于实时荧光PCR平台的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒多根据病毒基因组中的开放阅读框1a/b(Opening reading frame 1ab， ORF1ab)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein， N)和包膜蛋白(Envelope protein， E)基因设计引物与探针[22]，检测灵敏度在200～1000 copies/mL范围内。

图2 RT-PCR检测原理(Taqman探针法)Fig.2 Principle of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR,Taqman probe technology)

实时荧光PCR平台具有灵敏度高、特异性好、操作简单等优点，并且大型医疗机构均拥有相关仪器设备，因此，是SARS-CoV-2核酸检测所使用的主要技术平台。然而，传统的实时荧光PCR平台的样本核酸提取与扩增检测需分开进行，对实验室条件和操作人员要求较高，依赖荧光定量PCR仪，检测时间需要2～4 h，不利于现场筛查和资源匮乏地区使用。此外，对于病毒核酸含量低至单拷贝数量级的样本，其检测灵敏度还不够高，易出现假阴性结果，且受荧光标记种类的限制，其检测靶标数目有限，难以实现多重组合筛查。

2.3 基于数字化平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

基于实时荧光PCR的SARS-CoV-2核酸检测存在弱阳性、假阴性结果的原因除了样本储存或提取外，检测方法本身灵敏度不够高也是重要因素。当病毒载量较低时，单个反应中有效病毒核酸可能只有单拷贝数量级，需要具有单分子检测能力的技术才能减少假阴性结果。数字化核酸检测平台是一种能对靶标分子直接计数的平台[23]，它利用微液滴生成系统或微反应单元阵列芯片，将核酸扩增检测体系(通常为PCR)分成上万个均匀的微小反应单元(图3)，每个反应单元中只有单个或零个靶标核酸分子，反应结束后，对每个反应单元的阴阳性计数，根据泊松分布原理即可获得起始靶标核酸的绝对浓度。因此，基于数字化平台的核酸检测方法可以准确测定起始浓度低至单拷贝的靶标核酸，解决了SARS-CoV-2检测因病毒载量低而产生的假阴性问题。

图3 数字化PCR检测原理Fig.3 Principle of digital PCR

目前，已用于SARS-CoV-2检测的数字化平台主要为基于自动化微滴芯片的数字PCR技术。在体系中加入RNA模板后，经一步反转录PCR反应，通过3种荧光标记探针分别在每个反应单元中报告SARS-CoV-2的ORF1ab基因、N基因及内控基因扩增产物，最终通过计算阳性微液滴的数目，可在2.5 h内对SARS-CoV-2进行高灵敏、高特异检测。有研究比较了微液滴数字化PCR(ddPCR)和实时RT-PCR(两种方法的靶基因均为ORF1ab基因和N基因)对323例新冠病毒感染患者样本的检测结果，发现高病毒载量的95例样本两种方法一致性为100%，而低病毒载量的样本中存在不一致的检测结果，其中67例RT-PCR检测为单基因阳性的样本中有41例ddPCR检测为双基因阳性，161例RT-PCR检测为阴性的样本中有4例ddPCR检测为阳性，这些RT-PCR检测为假阴性的样本经ddPCR显示病毒绝对量为11.1～123.2 copies[24]，表明数字化PCR技术用于SARS-CoV-2检测更灵敏。此外，由于数字化PCR技术定量分析性能更好，可用于疾病发展不同阶段的SARS-CoV-2含量监测, 进而对病情进行评估。

尽管数字化平台在检测灵敏度和定量性能方面优于其它平台，但数字化检测平台的仪器设备较昂贵，检测通量有限，不适于对大量样本进行检测。此外，受限于荧光检测通道，该平台难以对多靶标进行多重检测。

2.4 基于核酸质谱平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

核酸质谱平台采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)对核酸片段进行分析[25,26]，常见的检测原理如图4所示。首先制备核酸样本并进行反转录扩增富集靶标序列，然后与基因特异性引物结合进行单碱基延伸反应，纯化后的反应产物进一步与芯片基质共结晶, 并在质谱仪上检测，期间核酸分子将受激光激发电离为单电荷离子在电场中飞行，由于飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在质谱仪真空管中的飞行时间可以直接获知其分子量，从而分析出待测基因信息。

图4 核酸质谱法检测原理Fig.4 Principle of mass spectrometry for nucleic acid analysisMALDI-TOF-MS, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry.

在中国医学装备协会发布的第二批新冠肺炎疫情防治急需医学装备目录中， Clin-ToF I飞行时间质谱仪、Clin-ToF II飞行时间质谱仪等入选，表明核酸质谱平台也可用于SARS-CoV-2的检测。

核酸质谱最大的优势在于可区分仅有单个碱基序列差异的寡核苷酸片段，这使多重检测无需荧光标记，仅通过质量标签即可实现，因此检测试剂的成本更低，检测通量更高。然而，运用核酸质谱平台检测靶标核酸，需经历样本前处理、PCR产物制备、产物纯化和质谱分析等多个步骤，操作繁琐，且样本处理要求高，MALDI不同的基质成分也会直接影响信号的检测。

2.5 基于纸基分析平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

纸基分析平台是一类在纸上完成生物化学分析的检测平台[27]，常见的为试纸条技术[28]，降低了对仪器设备的依赖。通常，纸基分析平台与核酸等温扩增技术偶联以进一步降低对仪器设备的依赖，如基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification， LAMP)的试纸条[29]、基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification， RPA)的试纸条[30]等。以LAMP反应为例，常见的试纸条检测原理如图5所示，63℃(60℃～65℃)恒定温度下，AMV逆转录酶将RNA转录为cDNA，并在3对LAMP引物(F3-B3、FIP-BIP和LF-LB)和具有链置换活性的Bst聚合酶作用下，生成大量带标记的靶标LAMP产物; 随后将产物加入试纸条的样品垫，在缓冲液作用下层析移动，并与结合垫处修饰的胶体金作用。由于结合垫处的胶体金修饰有抗体和链霉亲和素，当存在靶标序列时，发生免疫亲和作用，试纸条上检测线和质控线位置均会出现肉眼可见的有色条带； 而无靶标时， 只有质控线位置出现有色条带。 因此，通过肉眼观察可直接判断阴阳性。

图5 基于逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)试纸条的检测原理Fig.5 Detection principle of test strip based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)

2017年出现的基于Cas13与RPA扩增偶联的SHERLOCK技术[31]已被用于检测SARS-CoV-2，该方法设计了特异性检测病毒刺突蛋白(Spike protein，S)基因和ORF1ab基因的核酸试纸条，1 h内可完成检测，灵敏度低至10～100 copies/μL[32]。此外，有研究报道将Cas12与RT-LAMP(反转录LAMP)偶联，建立了基于试纸条可视化检测SARS-CoV-2的方法，可在45 min内检测浓度低至10 copies/μL的RNA提取物[33]，为SARS-CoV-2现场快速检测产品的开发提供了思路。

基于纸基分析平台的SARS-CoV-2检测技术采用恒温扩增反应，不需要精密仪器，扩增速度快，将扩增产物加到试纸条上或将试纸条插入结束后的反应体系中即可显示结果，无需依赖专业分析设备，通过观察颜色，肉眼可直接判断有无靶标病毒，因此操作简便，检测速度快，能满足即时检测的需求，特别适合实验设备简陋地区或应急情况下的病原体核酸检测。然而，以试纸条为代表的纸基分析平台尚未兼容SARS-CoV-2的提取和纯化操作，检测反应仍需在管内进行，需要开管进行试纸条显色反应，存在产物交叉污染的风险。此外，纸基分析平台检测通量低，多数方法无法定量分析，因此只能用于病原体核酸的低通量定性检测。

2.6 基于微流控平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

传统的生化检测方法包括样本制备、试剂处理、生化反应发生和检测多个阶段，而微流控平台则能将传统的多步或全部操作整合到一个小型平台上。如在纸基平台片上发展出的微流控平台检测技术，即纸芯片技术[34]，样本的核酸提取与检测操作均整合在纸基芯片上，通过折纸工艺或纸制移动阀操纵反应的进行[35, 36]。然而，纸芯片技术人工操作多、灵活性差，仍处于实验室研究阶段，尚未用于SARS-CoV-2的检测。目前，发展较为成熟的微流控平台通常以具有良好的光学透明性、电绝缘性及反应惰性的材料(石英、聚二甲基硅氧烷等)加工制成的微流控芯片技术为主，大小仅为几平方厘米，利用微通道、微泵、微型进样阀和微型出口等装置构成允许少量液体流动的自动操纵系统[37]，达到了快速、高效、准确地分析检测样本的目的。由于微流控平台配套的仪器体型小，质量轻便，因此，特别适合医疗资源缺乏地区检测项目的开展，助力病原体的现场快速筛查和检测。

博奥晶典生物公司开发了六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒 (恒温扩增芯片法)，配合该公司的恒温扩增微流控芯片核酸分析仪，在简单的样本核酸提取后，混合核酸扩增试剂即可上样芯片， 在微流控平台自动进行后续反应，1.5 h内完成包括SARS-CoV-2在内6种呼吸道病毒的检测，对SARS-CoV-2能达到每反应检测15 copies病毒分子的灵敏度，为新冠疫情防控工作提供了高效的检测工具。

基于微流控芯片平台的SARS-CoV-2检测技术将样本检测的多步反应集成在了体积微小的芯片上，对检测试剂和样本的需求量都大大减少，且反应速度快、自动化程度高，通过精巧的芯片设计提高了核酸检测通量。然而，目前多数商品化微流控芯片平台仍无法兼容样本核酸提取的步骤，尚未实现全自动化的核酸检测目标。此外，芯片的设计和制作成本较高，有待进一步优化方案， 降低检测成本。

2.7 基于整合型自动化平台的SARS-CoV-2核酸检测技术

在不同核酸检测技术平台中，核酸提取操作是实现病原体准确检测的重要环节。常规的核酸提取分为手动提取和仪器自动化提取两种方式，但在实际检测过程中均需人工将提取产物加入检测体系，当处理含传染性较强的病毒样本时, 会增加实验人员的感染风险。为了避免单独进行样本核酸提取操作产生的问题，整合型自动化核酸检测平台应运而生，这是一类集样本提取、核酸检测和结果输出于一体的封闭式自动化核酸检测系统，既可避免过多的人工操作带来的误差和生物安全问题，也可避免样本检测时的交叉污染风险。

第一个整合型自动化分析平台为GeneXpert快速检测系统，其核心为一台能实现全自动样品制备和检测的实时荧光定量PCR仪。只需在系统配套的封闭式卡盒中加入采集的原始样本，仪器装载卡盒后, 将自动完成样本裂解、核酸提取、定量PCR检测等一系列操作，并输出反应结束后的分析结果，达到 “Sample in-Anwser out”(样本进-结果出)的效果。目前已开发出基于GeneXpert快速检测系统的新产品Xpert®Xpress SARS-CoV-2，可在45 min内完成样本的定性检测，大大提高了SARS-CoV-2的检测效率。然而, GeneXpert平台的研发主要基于PCR类方法[38]，这类方法需要热循环过程，对温控要求高，因此仪器价格昂贵; 此外，该平台试剂耗材成本也较高，不适于临床推广。因此，发展恒温条件下的核酸扩增和检测技术将有利于自动化检测仪器的成本控制，进而降低临床样本的检测成本。RNA实时荧光恒温扩增检测技术(Simultaneous amplification and testing, SAT)是一种RNA检测新技术，该技术通过逆转录将T7启动子引入cDNA中，生成DNA双链后，再由T7 RNA聚合酶催化反应生成多个含靶标序列的RNA分子，随后进入下一轮RNA逆转录与转录循环，全程由能结合靶标RNA的分子信标实时报告检测信号，整个反应在42 ℃ 进行，实现了恒温条件下RNA靶标的高效扩增与检测[39]。2020年3月， 上海仁度生物公司基于全自动SAT核酸分析系统(AutoSAT)成功开发了全自动SARS-CoV-2核酸检测平台，实现了“样本进-结果出”的封闭式自动化检测，可对单个样本或批量样本进行处理，第一个样本从进样到出报告时间为90 min，24 h内可完成700个样本的批量检测。

基于整合型自动化平台的SARS-CoV-2检测技术将样本提取、核酸检测与结果输出整合在一套系统内，达到了“样本进-结果出”式全自动检测病原体核酸的目的，该平台无需专业的实验操作人员和严格的实验室环境，仪器便携，且检测效率高、重复性好，因此特别适合病原体现场快速筛查。然而，目前整合型自动化平台仍处在发展阶段，仪器和耗材的价格较高，多数仪器单次运行的检测通量较低，因此，在临床推广前尚有较大的发展空间。

上述技术平台在核酸检测方面具有各自的优势与不足(表1)，因此，在应用这些技术检测SARS-CoV-2时，需根据实际情况选择技术平台。如在资源紧张的应急情况下，适合选用纸基分析平台和微流控平台，实现对SARS-CoV-2的现场快速筛查; 当样本提取获得的核酸浓度较低或常规检测结果呈弱阳性时，适合选用数字化平台，实现对低病毒载量样本的准确检测。

3 结论与展望

目前，世界范围内COVID-19的确诊人数仍在增加，SARS-CoV-2核酸检测技术也在不断发展。本文从核酸检测技术平台出发，介绍了SARS-CoV-2的主要检测技术，由于不同技术平台在核酸检测方面具有各自的优势与不足，在实际应用中需根据实际情况和具体要求选择检测方法。通过比较发现，具有检测快速、成本低廉、不依赖大型设备等优势的POCT(Point-of-care testing)类技术，在对SARS-CoV-2检测时， 也暴露出安全性不足、灵敏度低等问题。为了应对SARS-CoV-2等具有传染性强、 潜伏期长等特点的恶性病毒， 核酸检测技术平台的后续发展需重视两点：检测方法需特异性好、灵敏度高、反应速度快; 仪器设备需人工操作少、通量高、制造成本低且更为便携。现有的全自动一体化SARS-CoV-2检测平台通量较低，多数平台只能通过并行运行多台仪器设备提高检测通量，无疑增加了仪器设备的成本。因此，发展高通量、全自动病原体检测平台是今后发展的趋势与面临的挑战。

表1 常见SARS-CoV-2核酸检测技术平台的比较