核-壳式雌二醇磁性分子印迹聚合物的制备及其吸附性能研究

王 悦 郭恺辰 田雪蒙 赵文昌 凯迪日耶·色提瓦力迪 高瑞霞*

1(西安交通大学化学学院，西安 710049) 2(西安奕斯伟硅片技术有限公司，西安 710077) 3(西安交通大学医学部，西安710061)

1 引 言

雌二醇(Estradiol，E2)是一种常见的环境内分泌干扰物[1]，环境水中的E2可以通过生物积累进入食物链。对人类、家畜及野生动物而言，适量的E2可促进生殖器官的发育，但若过度累积则会给健康和生殖带来不良影响[2,3]。因此，环境水样品中E2的准确检测具有重要意义。常用的检测方法有高效液相色谱-质谱法[4,5]、毛细管电泳法[6]等。但是，由于环境水样品基质复杂、干扰物质种类繁多，且E2处于痕量水平(ng/L)，不易直接被分析仪器准确检测[7]，在检测前需对样品进行预处理。固相萃取技术因具有简单、快速、溶剂用量少等优点而成为较为普遍采用的样品前处理技术[8]。然而，传统固相萃取剂对目标物的特异性吸附能力较低[9]，因此有必要开发一种新型吸附剂，用于选择性分离和富集环境水样品中的E2。

磁性分子印迹聚合物将表面分子印迹技术与磁性纳米颗粒相结合，不仅可实现快速分离，还具有制备可预定性、高选择性、无模板泄露、传质速率快等优点，是理想的固相萃取剂，已被广泛应用于分离材料[10]、药物传输[11]、模拟抗体[12]和生物化学传感器[13]等领域。以磁性分子印迹聚合物为固相萃取剂，对环境水样品中痕量E2进行吸附的研究已有文献报道。Zhu等[14]以丙烯酰胺和2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸为功能单体，制备了磁性分子印迹聚合物，用于选择性识别和提取环境水样品中的E2。Ming等[15]以甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，2,2’-偶氮二异丁腈为引发剂，合成核-壳结构的磁性印迹材料，实现了环境水样品中E2的检测。尽管这些磁性分子印迹聚合物在分离方面展现出独特的优势，但由于亲水性功能单体种类有限、聚合物多在有机相中制备等，导致其与水的相溶性差，对环境水样品中E2提取效率低。开发新的亲水性功能单体是解决该问题的重要途径之一。

苯胺(AN)廉价易得，富含氨基、羟基和苯环，是印迹聚合物最常用的功能单体。Wen等[16]以Fe3O4为载体，苯胺为功能单体，肌酸酐为模板分子，通过表面分子印迹技术合成亲水的磁性分子印迹聚合物，实现了对人血浆和尿液中肌酸酐的高效吸附。Han等[17]以修饰了Fe3O4的石墨烯为载体，在其表面包覆聚苯胺印迹层，所得印迹聚合物对饮料中的目标物表现出良好的吸附性能。亲水性功能单体苯胺可通过氢键和π-π等非共价相互作用与E2相结合，以其为功能单体制备的磁性分子印迹聚合物有望实现对环境水样品中E2的选择性吸附。

基于此，本研究以苯胺为功能单体，羧基磁球为载体，E2为模板分子，过硫酸铵为引发剂，采用固定模板印迹策略，制备了核-壳式雌二醇磁性分子印迹聚合物(MIPs-E2)，用于选择性识别环境水样品中的E2。采用透射电子显微镜、傅里叶红外光谱仪、X射线衍射仪和振动样品磁强计等进行表征，证明所合成的材料粒径均一、分散性好、晶型结构稳定且具有超顺磁性。动力学吸附、等温吸附、选择性吸附和重复利用性实验进一步证明，所得材料对E2吸附量大、传质速率快、选择性高、可重复利用性好。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LC-2130高效液相色谱仪(日本日立公司); JEM-2100透射电子显微镜(日本JEOL公司); LDJ 9600-1振动样品磁强计(美国LDJ Electronics公司); D/max/2500v/pc X射线衍射仪(日本Rigaku公司); AVATAR 330傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司); HY-2调速多用振荡器(上海强运科技有限公司); AWL-0502-U艾科浦超纯水系统(重庆颐洋企业发展有限公司)。

FeCl3·6H2O(分析纯，天津市福晨化学试剂厂); 聚丙烯酸钠(SPA，分析纯，成都市科龙化工试剂厂); 乙二醇(EG)、二甘醇(DEG)、乙酸(HAc)、HCl(37%)、无水乙酸钠(NaOAc)和乙醇(Ethanol)(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司); 分析纯雌二醇(E2)、苯胺(AN)、过硫酸铵(APS)、己烯雌酚(DES)、雌三醇(E3)和雌酮(E1)(Sigma-Aldrich化学试剂公司)。实验用水为超纯水(18.2 MΩ cm)。

2.2 羧基磁球(Fe3O4-COOH)的制备

采用文献[18]的方法制备Fe3O4-COOH。将0.51 g FeCl3·6H2O、2.03 g NaOAc、0.05 g SPA混合，再加入7 mL EG和15 mL DEG，超声混匀，在高压反应釜中200℃下反应12 h，自然冷却至室温。产物用超纯水洗涤至上清液澄清，40℃下真空干燥至恒重，即得到Fe3O4-COOH。

2.3 雌二醇磁性分子印迹聚合物(MIPs-E2)和非分子印迹聚合物(NIPs)的制备

将200 mg Fe3O4-COOH和30 mg E2溶于50 mL超纯水中，搅拌30 min。依次加入200 mg AN、70 mg APS和4 mL HCl，室温下搅拌反应24 h。所得产物用超纯水洗涤至上清液澄清，40℃真空干燥至恒重。以乙醇-乙酸(95:5，V/V)为洗脱剂去除聚合物中的E2，直至用HPLC-UV在洗脱液中检测不出E2，即得MIPs-E2。NIPs的制备除不加E2之外，其它步骤与制备MIPs-E2相同。

2.4 MIPs-E2的吸附性能考察

2.4.1 动力学吸附实验将10 mg MIPs-E2和NIPs分别置于5 mL 0.35 mg/mL E2乙醇溶液中，室温下分别振荡1、5、15、20、30、40和50 min 后，磁性分离，采用HPLC-UV测定上清液中E2的浓度[19]。

2.4.2 等温吸附实验将10 mg MIPs-E2和NIPs分别置于5 mL 含E2的乙醇溶液(浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45和0.50 mg/mL)，室温下振荡30 min后，磁性分离，采用HPLC-UV测定上清液中E2的浓度。

2.4.3 选择性吸附实验将10 mg MIPs-E2和NIPs分别置于5 mL含E2、E1、E3和DES的乙醇溶液(浓度均为0.35 mg/mL)，室温下振荡30 min后，磁性分离，用HPLC-UV测定上清液中E2的浓度。

2.4.4 重复利用性实验将10 mg MIPs-E2和NIPs分别置于5 mL 0.35 mg/mL E2乙醇溶液中，室温下振荡30 min后，磁性分离，用洗脱液将吸附材料中的E2洗脱完全，将洗脱后的MIPs-E2再次置于相同浓度的E2溶液中。如此重复实验6次。

2.4.5 数据统计显著性分析采用SPSS 16.0软件对数据进行分析，所有数据经正态性检验和方差齐性检验，呈正态性分布及方差齐性的计量数据以x±s表示，多组间数据比较首先采用单因素方差分析，经检验后，若差异有显著统计学意义，再采用LSD-t对组间进行两两比较， 两组间的数据比较采用两个独立样本进行T检验。p<0.05，认为有显著性统计学差异。

3 结果与讨论

3.1 MIPs-E2的制备

本研究结合表面分子印迹技术和磁性分离技术，在水相中制备了MIPs-E2(如图1所示)。首先，采用溶剂热法制备Fe3O4-COOH磁性纳米粒子[18]，通过氢键作用将模板分子E2固定在其表面; 然后，以AN为功能单体，APS为引发剂，在形成印迹层的同时，通过氢键和π-π相互作用将模板分子E2再次固定; 最后，采用乙醇-乙酸(95∶5，V/V)作为洗脱液去除印迹层中的E2; 得到MIPs-E2。

图1 MIPs-E2的制备过程Fig.1 Synthesis process of MIPs-E2MIPs-E2: Magnetic molecularly imprinted polymers of estradiol; SPA: Sodium polyacrylate; EG: Ethylene glycol; DEG: Diethylene glycol; E2: Estradiol; AN: Aniline; APS: Ammonium peroxysulfate

为获得最佳印迹效果，对制备MIPs-E2时APS和AN的用量比、AN的用量及聚合时间进行了考察。固定AN的量为200 mg，改变APS的用量，使APS和AN的质量比分别为1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶3, 考察吸附量(Adsorption capacity,Q)和印迹因子(Imprinting factor, IF)。

IF=QMIPs/QNIPs

(1)

其中,QNIPs和QNIPs(mg/g)分别代表MIPs-E2和NIPs对目标物的吸咐量。如图2A所示，Q和IF随着AN比例的增加而先增加后减小，当APS和AN的比例为1:1.5(w/w)时达到最大值。这可能是因为过量的APS导致体系活动中心相对较多，不利于生成高分子量的聚苯胺，且聚苯胺的过氧化程度增加[20]，不利于形成有效印迹位点; 当APS与AN的比例为1∶1.5(w/w)时，交联程度最佳，有效的印迹位点数目最多; 随着AN比例继续增加，由于APS的量相对过少，导致聚苯胺产率较低。被包覆在聚苯胺印迹层内的E2数量有限，有效印迹位点的数目减少。NIPs对E2的吸附量随着AN比例的增加而增大，这可能是由于NIPs与E2的结合是非特异性结合，随着交联程度减小，聚苯胺的过氧化程度减小，材料表面所暴露的官能团更加丰富，非特异性吸附增加。实验结果表明，APS和AN的最佳质量比为1∶1.5。在APS和AN的最佳质量比下，选择AN的用量为100、150、200、250和300 mg，进行考察(图2B)。

图2 APS和AN的用量比(A)、AN用量(B)和时间(C)的影响(* p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001，以MIPs-E2对E2的最大吸附量为对照组)Fig.2 Effect of the mass ratio of APS to AN (A), amount of AN (B), and polymerization time (C) on imprinting performance of MIPs-E2 and NIPs (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, vs. control group of the maximum adsorption capacity of MIPs-E2 for E2)NIPs: Non-imprinted polymers; Q: Adsorption capacity; IF: Imprinting factor

Q和IF随着AN用量的增加而增加，且当AN用量为200 mg时，Q和IF达到最大值，表明随着AN的增加，更多的E2与AN相结合，形成的印迹位点增多; 当AN的用量大于200 mg时，Q和IF逐渐减小，这可能是因为过多的AN会形成较厚的印迹层，E2不易被洗脱，且洗脱后，E2也不易接近识别位点，导致吸附效果不佳。实验结果表明，AN的最佳用量为200 mg。

在APS和AN最佳质量及AN最佳用量下，选取聚合时间为12、18、24、30和36 h进行考察(图2C)。聚合时间小于24 h时，Q和IF较小，这可能是因为较短的聚合时间导致印迹层内印迹位点数目较少; 聚合时间为24 h时，Q和IF最大，E2与AN充分作用，印迹层内形成足够多的印迹位点; 聚合时间大于24 h时，Q和IF变小，这可能是由于过长的聚合时间导致AN过度自聚，印迹位点被包埋于其中，E2难以洗脱，且洗脱后重吸附时，E2难以到达包埋较深的印迹位点。因此，选择最佳聚合时间为24 h。

图3 Fe3O4-COOH (A)和MIPs-E2(B)的透射电镜图Fig.3 Transmission electron microscope (TEM) images of Fe3O4-COOH (A) and MIPs-E2 (B)

3.2 材料表征

图3为Fe3O4-COOH和MIPs-E2的透射电镜(TEM)图。由图3A可见，Fe3O4-COOH呈类球状，分散性较好，粒径约为100 nm且较均一。图3B显示，Fe3O4-COOH表面包覆有约6 nm的印迹层，证明成功合成了MIPs-E2。所形成的较薄印迹层有利于E2在吸附液和MIPs-E2表面的传质，使E2更易接近印迹位点，达到快速吸附的效果。

图4B为所得磁性纳米材料的X射线衍射(XRD)图。两个样品中均能观察到Fe3O4的6个特征峰(2θ=30.38°、35.58°、43.14°、53.48°、57.08°和62.66°)，与2θ值相对应的峰位置指数分别是(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)[22]，与JCPDS卡(19-629)中Fe3O4的数据一致。相较于Fe3O4-COOH，MIPs-E2峰的位置并没有明显改变，说明印迹层的包覆并未破坏Fe3O4的晶型结构。

对Fe3O4-COOH和MIPs-E2的磁学性能进行了考察。由图4C可知，Fe3O4-COOH和MIPs-E2的饱和磁化强度值分别为81.60和74.93 emu/g。在外加磁场作用下，可实现MIPs-E2与吸附液的快速分离。

图4 Fe3O4-COOH(a)和MIPs-E2(b)的红外光谱(A)、X射线衍射(B)和磁滞回线(C)图Fig.4 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra(A), X-ray diffraction (XRD) patterns (B), and magnetization curves (C) images of Fe3O4-COOH (a) and MIPs-E2 (b)

3.3 材料的吸附性能

3.3.1 动力学和等温吸附性能动力学吸附曲线如图5A所示。0～5 min，MIPs-E2对E2的吸附过程为快速吸附，随着吸附时间延长，印迹位点逐渐被占据，在30 min达到吸附平衡。采用准一级及准二级动力学方程对动力学吸附数据进行拟合:

ln(Qe-Qf)=lnQe-k1t

(2)

(3)

其中，Qt(mg/g)为MIPs-E2或NIPs在t时刻对E2的吸附量，t(min)为吸附时间，k1(g/mg min)和k2(g/mg min)分别为准一级和准二级动力学常数，Qe(mg/g)为平衡时聚合物对E2的理论吸附量。MIPs-E2和NIPs的动力学吸附数据拟合结果见表1。相较于准一级动力学方程，MIPs-E2和NIPs的准二级动力学方程的相关系数均大于0.99，说明所制备的聚合物对E2的吸附更符合准二级动力学模型，化学吸附是其对E2吸附的决速步骤[23]。

表1 MIPs-E2和NIPs对E2的动力学吸附拟合参数

如图5B所示，当E2浓度低于0.35 mg/mL时，随着吸附液中E2浓度的增大，MIPs-E2对E2的吸附量显著增加; 当吸附液中E2的浓度为0.35 mg/mL时，印迹位点被完全占据，吸附达到动态平衡。此外，MIPs-E2对E2的最大吸附量(21.34 mg/g)远大于NIPs(7.90 mg/g)，这是因为NIPs对E2的吸附仅有非特异性吸附，而MIPs-E2对E2具有特异性识别位点，可通过特异性和非特异性两种吸附方式吸附更多E2。用Langmuir及Freundlich等温吸附模型分析MIPs-E2和NIPs对E2的等温吸附数据，模型方程式如下:

(4)

lgQ=mlgCe+lgKF

(5)

式中，Q(mg/g)和Qmax(mg/g)分别为MIPs-E2或NIPs对E2的平衡吸附量和表观最大吸附量，Ce(mg/mL)为平衡时E2在吸附溶液中的浓度，KL(mL/mg)和KF(mg/g)分别为Langmuir和Freundlich模型吸附平衡常数，m是Freundlich方程中的指数，代表体系的不均匀度。由表2可知，相较于Freundlich等温吸附方程，MIPs-E2和NIPs Langmuir等温吸附方程的相关系数均大于0.99，说明MIPs-E2和NIPs对E2的吸附更符合Langmuir等温吸附模型，属于单层吸附系统[24]。

图5 MIPs-E2和NIPs的动力学(A)和等温(B)吸附曲线(* p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001，以相同时间或浓度下NIPs对E2的吸附量为对照组)Fig.5 Adsorption kinetic (A) and isothermal (B) absorption curves of MIPs-E2 and NIPs for E2(* p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001, vs. control group of the adsorption capacity of NIPs for E2 at the same time or concentration)

表2 MIPs-E2和NIPs对E2的等温吸附拟合参数

3.3.2 材料的选择性吸附性能选择性吸附能力是评价材料印迹效果的一个重要指标[25,26]，通常采用IF和选择性因子(SC)评价，计算公式如下:

(6)

其中， IFTEM和IFCOM分别代表聚合物对E2和其竞争物的印迹因子。

图6 MIPs-E2和NIPs对E2、雌三醇(E3)、雌酮(E1)和己烯雌酚(DES)的选择性吸附性能(**p<0.01， 以MIPs-E2对E2的吸附量为对照组)Fig.6 Adsorption selectivity of MIPs-E2 and NIPs towards E2, Estriol (E3), estrone (E1), and diethylstilbestrol (DES) (**p<0.01, vs. control group of the adsorption capacity of MIPs-E2 for E2)

本研究选择与E2结构类似的常见共存物E1、E3和DES作为竞争物，对MIPs-E2和NIPs的选择性吸附性能进行考察。由表3和图6可知，MIPs-E2对E2的吸附量(Q=21.34 mg/g)和印迹因子(IF=2.65)均高于对其竞争物，说明MIPs-E2中印迹位点的空间结构、形状大小和化学官能团与E2高度匹配。值得注意的是，在3种竞争物中，MIPs-E2对E3的吸附效果优于E1和DES，这是因为E3结构与E2高度相似，均含有苯环与五元环，可与AN产生较强的π-π相互作用，且五元环上连有的羟基增加了与AN之间的氢键作用。NIPs对E2及其竞争物E1、E3和DES的吸附基本没有差别，这是因为NIPs对目标物的吸附作用为非特异性吸附。实验结果表明，MIPs-E2对E2的选择性高，印迹效果明显。

表3 MIPs-E2和NIPs对E2、E3、E1和DES的吸附量(Q)、印迹因子(IF)及选择性因子(SC)

3.3.3 材料的重复利用性能重复利用性也是评价印迹材料优劣的重要指标。本研究选用同一个聚合物进行6次吸附-解吸附实验，对MIPs-E2和NIPs的重复利用性进行考察。随着重复利用次数增多，MIPs-E2对E2的吸附量相对减少。重复使用6次后，MIPs-E2对E2的吸附量仍然可达到初始吸附量的93.4%，说明所制备的MIPs-E2具有良好的重复利用性。

4 结 论

采用Fe3O4-COOH为载体，E2为模板分子，AN为功能单体，APS为引发剂，结合表面分子印迹技术和磁性分离的优势，制备了对E2具有选择性识别能力的新型磁性分子印迹聚合物MIPs-E2。通过TEM、FT-IR、XRD和VSM对制备的磁性纳米材料进行表征，并通过等温吸附、动力学吸附、选择性吸附和重复利用性实验对所得磁性纳米材料的特异性识别能力和稳定性进行考察。结果表明，所得MIPs-E2不仅表现出良好的形貌和高的饱和磁化强度，还具有较快的动力学吸附速率、较高的吸附量及良好的选择性和重复利用性能，可望应用于环境水样品中痕量E2的检测。