QuEChERS-HPLC-MS/MS测定淡水鱼中硝基呋喃代谢物残留

（浙江优科检测技术有限公司，浙江 杭州 311100）

硝基呋喃类药物主要包括呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃它酮，是一类人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗生素。因其对大多数革兰阴性菌、革兰阳性菌和原虫等病原体均有较强的抑制和灭杀作用[1]，被广泛用于水产养殖业。有研究发现，硝基呋喃类化合物是直接致变剂，呋喃唑酮及其代谢物具有较强致突变、致畸和致癌作用[2]，已被大多数国家禁止用于动物性食品[3]。我国农业部于2002 年发布的第193号、第235号公告和2005年发布的第560号公告，将硝基呋喃类药物列为禁用兽药，严禁用于所有食品动物[4]。但硝基呋喃药物疗效好、价格低廉，为提高水产品的成活率，提高经济效应，一些养殖户在水产品养殖过程中非法使用硝基呋喃类药物的现象仍然存在。

硝基呋喃类抗生素不稳定、代谢快，在动物体内的半衰期短，但其代谢物常与组织中的蛋白质以结合态的形式存在，可长期、稳定地残留于动物体内[5]，因此，目前通常以测定其代谢物的方式来监控硝基呋喃类药物在动物体内的残留量。

目前，硝基呋喃代谢物残留的检测方法主要有酶联免疫法（ELISA）[6]、高效液相色谱（HPLC）[7]、高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）[8]及高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）[2-4]。其中，ELISA采用了特异性抗体，具有灵敏度高、经济、操作简便、检测时间短等优点，一般适用于筛选检测，假阳性率较高。HPLC和HPLC-MS广泛用于多组分混合物的分离和分析，但动物组织基质比较复杂，干扰较多，其准确性和灵敏度难以达到痕量分析的要求。HPLC-MS/MS采用多反应监测模式（MRM）模式，结合液相保留时间及MRM特征离子对进行定性和定量，可减少于保留时间相同而待测离子不同所带来的干扰，同时提高了检测灵敏度，尤其适合于基质复杂样品的分析，已成为食品中硝基呋喃代谢物残留检测的主流分析方法[9]。

鱼肉样品通常含蛋白质和脂肪，基质复杂，通常需要净化等前处理[10]，目前对动物性食品中硝基呋喃代谢物残留检测的净化方法主要有正己烷去脂肪[4]及固相萃取法[8]，这两种方法操作都比较繁琐，不适于快速检测。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）方法操作简便，回收率好，操作效率高，最早应用于农药残留检测，在鱼肉中也有关于氯霉素[11]、磺胺[12]和孔雀石绿[13]的检测研究报道，但在硝基呋喃代谢物检测中的应用较少。本试验在农业部783 号公告-1-2006的基础上[14]，用QuEChERS净化样品，进一步减少样品基质干扰，采用HPLC-MS/MS检测硝基呋喃类药物代谢物，为淡水鱼中硝基呋喃代谢物残留量的快速检测提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

QSightTMAltus LC 30-QsightTM3Q Mass Spectrometer（高效液相色谱-串联质谱联用仪，美国Perkin Elmer公司）； 3K15台式高速离心机（德国Sigma）；N-EVAP 12管氮气浓缩仪（上海安谱）；Vortex Genius 3涡旋振荡器（德国IKA）。

1.2 试剂

乙酸乙酯，甲酸（色谱纯，美国Fisher Chemical）；Bond Elut QuEChERS萃取盐包（内含4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g 柠檬酸钠，0.5 g三水合二柠檬酸二钠，上海安谱）；15 ml Bond Elut QuEChERS净化管[内含50 mgN-丙基乙二胺固相吸附剂（PSA）和150 mg C18，900 mg Na2SO4，美国Agilent公司]；Al2O3填料，100～300目（上海安谱）；2-硝基苯甲醛（百灵威）；HCl，NaCl，Na2SO4（分析纯，广州化学试剂有限公司）；5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ），氨基脲（SEM），1-氨基-2-内酰脲（AHD），3-氨基-2-恶唑烷基酮（AOZ，北京坛墨质检科技有限公司）。

2 方法

2.1 样品处理

称取鱼肉样品4.00 g于50 ml离心管，加0.2 mol/L盐酸溶液8.00 ml，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15 ml，涡旋混合1 min，37 ℃水浴恒温震荡衍生16 h。衍生后的样品加入0.3 mol/L Na2SO41 ml，用2 mol/L NaOH调pH至7.0～7.5，加入10 ml乙酸乙酯，涡旋混匀后加入萃取盐包，涡旋提取1 min，8000 r/min、4 ℃离心5 min，取6 ml上清，移入QuEChERS净化管，涡旋1 min后，8000 r/min、4 ℃离心5 min。取5 ml上清，40 ℃下氮吹至干，用20 %甲醇水1.00 ml溶解，过0.22 μm滤膜后供HPLC-MS/MS测定。

同时除不加样品外，按上述步骤处理，做方法空白试验；另称取样品后添加混合标准溶液，按上述步骤处理样品，做质量控制实验。

2.2 仪器条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，8 μm），柱温30 ℃，进样量5 μl，流动相为2 mmol/L乙酸铵溶液和甲醇，流速0.3 ml/min，梯度洗脱程序见表1。正离子模式，离子化喷雾电压4500 V，离子源温度400 ℃，质谱接口加热气温度300 ℃，雾化器温度150 ℃，反吹干燥气100 ml/min，MRM参数见表2。

表1 HPLC梯度洗脱程序

表2 硝基呋喃代谢物衍生物质谱分析参数

2.3 结果计算

样品中硝基呋喃代谢物含量按公式X=（Ci×V）/m计算。其中X为样品中硝基呋喃代谢物的含量（μg/kg）；Ci为样品溶液中硝基呋喃代谢物的浓度（ng/ml）；m为样品质量（g）。

3 结果与分析

3.1 前处理条件优化

鱼肉中含丰富的脂肪酸和蛋白质，乙酸乙酯提取目标衍生物的同时，也会提取出这些非极性干扰物，影响定性和定量分析结果，增加仪器的维护成本。QuEChERS作为一种快速的前处理技术，最早应用于农药残留检测，一般分为萃取和净化两部分。萃取盐包中的柠檬酸钠和三水合二柠檬酸二钠可保持提取溶液的pH稳定；NaCl能促进目标物从水相到有机相的转移；MgSO4能大量吸收样品中的水分，减少水相，促进目标物在有机相中的转移，且MgSO4的水合作用会放出大量热量，更有利目标物从水相转移到有机相。C18和PSA是常用的吸附材料，其中C18除脂肪能力较强，PSA可同时减少脂类、糖类和其他有机酸的干扰，但鱼肉中基质复杂，分析脂肪含量较高的样品时，C18和PSA的组合不能完全去除脂质影响，因此本试验在美国Agilent公司提供的QuEChERS前处理方案基础上，添加脂肪吸附能力更强的Al2O350 mg，达到更好的净化效果。经过改进的QuEChERS前处理后，4种硝基呋喃代谢物衍生物的色谱分离结果见图1。由图1可见，4种硝基呋喃代谢物分离效果良好，峰形尖锐，无杂质干扰，获得良好的色谱分离效果。

图1 4种硝基呋喃代谢物衍生物的色谱图

3.2 标准曲线及检出限、定量限

分别移取硝基呋喃代谢物混合标准工作液（100 ng/ml） 0.02，0.04，0.10，0.20，0.40 ml于50 ml离心管，除不加样品外，按2.1项步骤前处理样品，配制成1，2，5，10，20 μg/L系列混合标准溶液，以各组分的浓度和峰面积建立标准曲线，以3倍信噪比（S/N）为检出限，以10倍S/N为定量限。各组分线性回归方程、相关系数、检出限和定量限见表3。

表3 4种硝基呋喃代谢物的标准曲线和相关系数

由表3可见，各组分的标准曲线相关系数均在0.998以上，检出限在0.07～0.16 μg/kg范围内，优于农业部783号公告-1-2006标准要求，定量限均小于0.5 μg/kg，优于标准要求。

3.3 方法回收率和精密度

准确称取4.00 g样品于50 ml离心管，分别添加硝基呋喃代谢物混合标准溶液（100 ng/ml）0.01，0.04，0.2 ml，4种代谢物的添加水平分别为0.25，1.00，5.00 μg/kg，按1.2步骤处理和净化样品，HPLC-MS/MS测定，做样品加标回收试验。每个加标水平做6个平行试验，考察方法的回收率和精密度。4种目标物的平均回收率为84 %～108 %，RSD为5.4 %～9.7 %，在农业部783号公告-1-2006要求范围内。3个浓度水平的回收率和精密度试验结果见表4。

表4 4种硝基呋喃代谢物的回收率和精密度试验结果（n=6）

3.4 实际样品分析

采用本文建立的QuEChERS-HPLCMS/MS处理并检测50批淡水鱼样品，结果仅有2份样品中检出AOZ阳性，其浓度分别为1.37和2.41 μg/kg，其他代谢物组分均未检出。

4 小结

本文采用改进的QuEChERS结合HPLC-MS/MS建立淡水鱼中硝基呋喃代谢物残留量的检测方法，平均回收率为84 %～108 %，RSD为5.4 %～9.7 %，检出限均小于0.2 μg/kg，定量限均小于0.5 μg/kg，各方法学性能指标均优于农业部783号公告-1-2006。该方法快速，简便，重复性好，灵敏度高，适用于淡水鱼样品中硝基呋喃代谢物的检测分析，并为其他水产品中硝基呋喃代谢物的检测提供参考。