环境因素对胡椒瘟病菌游动孢子产量的影响①

高圣风 杨开虎 刘爱勤 苟亚峰 孙世伟 王 政 孟倩倩

(1 中国热带农业科学院香料饮料研究所 海南万宁 571533;2 海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室 海南万宁 571533;3 云南农业大学热带作物学院 云南普洱 665000)

胡椒瘟病广泛分布于世界上所有胡椒生产国家和地区，也是危害中国胡椒生产的首要病害，其病原物是辣椒疫霉（Phytophthora capsiciLeon.）［1-2］。该病害于 20 世纪 70 年代在中国海南主产区一度爆发流行，摧毁了大片胡椒园，致使海南省胡椒种植面积缩减20%以上［3-4］。胡椒瘟病主要危害胡椒主蔓基部，植株染病后死亡率极高，可随风雨和农事操作向四周迅速传播，控制病源和切断传播途径是防控该病害的一贯方针［3-4］。

游动孢子在有水环境中能够识别寄主并主动游到寄主表面完成侵染，是辣椒疫霉最主要的侵染源和传播形式［5-6］。游动孢子的数量多少是决定辣椒疫霉病害能否爆发流行的关键，也是国内外科学家关注的热点。程颖超等［7］分析了Actin基因序列差异并特异性引物YM2F/YM2R，开发了基于实时荧光定量PCR的游动孢子定量检测技术，以监测和评估病害发生趋势。Dong 等［8］基于辣椒疫霉ITS 序列的特异性和环介导等温扩增（LAMP），建立了更为简便快速的辣椒疫霉定性检测技术。Ivey 等［9］开发了利用荧光染料 FUN-1 实时监测辣椒疫霉游动孢子产量的方法。明确自然环境中影响胡椒瘟病菌游动孢子产量的因素，是认识和防控该病害的重要基础。

培养基对辣椒疫霉游动孢子产量的影响广受关注。已报道的辣椒疫霉产孢培养基种类有很多，包括V8 蔬菜汁培养基（V8），黑麦培养基（RA）、胡萝卜培养基 （CA）、大豆培养基 （BA） 等等［9-12］。但是，不同来源的菌株在相同培养基上的游动孢子产量存在差异。张荣等［13］采用光照诱导的方法分析了来源于广州的辣椒疫霉在5种培养基上的游动孢子产量，发现其在燕麦琼脂培养基上产生游动孢子的数量最多。侯全刚［14］对同样5 种培养基开展研究，发现分离自青海循化县的辣椒疫霉在马铃薯培养基上的游动孢子产量显著高于其他培养基［14］。

影响辣椒疫霉游动孢子产量的环境因素有很多，其中光照是公认的诱导辣椒疫霉产生游动孢子的必要条件。王晓敏等［15］和李立凤等［16］分析不同光照方式对辣椒疫霉游动孢子产量的影响，发现持续黑暗培养无法产生游动孢子，全光照条件下游动孢子产量显著高于间歇性光照，全光培养条件下游动孢子产量随光照时间的延长而增多［15-16］。许亚池等［12］研究发现，黑暗培养 5 d 的辣椒疫霉菌经光照诱导后可以产生多达106个/mL的游动孢子，加入无菌水淹没菌丝能够显著提高游动孢子产量。兰成忠等［10］研究发现，辣椒疫霉经黑暗培养后，用玻棒将菌丝轻轻涂抹压倒后再光照诱导，获得的游动孢子产量显著高于加无菌水淹没菌丝后直接光照诱导［10］。诱导辣椒疫霉产孢的温度条件通常认为25～26℃最佳，但是不同来源的菌株间也存在差异。侯全刚［14］发现分离自青海循化县的辣椒疫霉在22～32℃均可产孢，30℃时产孢量最高。此外，自然环境中作物根系分泌物对辣椒疫霉游动孢子产量也有影响。王继元等［17］发现，在不同抗性的品种之间，抗病强的辣椒品种PRMND 和DNP56 的根系分泌物能够显著抑制辣椒疫霉游动孢子囊形成，而感病品种‘科星6号’则没有明显差异。

以上相关研究中的辣椒疫霉菌株均分离自辣椒、南瓜等温带蔬菜作物。胡椒瘟病菌虽然属于辣椒疫霉种，但是其在遗传学系统发育树上与来源于温带的辣椒、茄子等作物上的辣椒疫霉菌，分属不同的分类亚群［18］。目前尚未见胡椒瘟病菌产孢影响因素相关报道。前期，本研究室建立了胡椒瘟病孢子囊及游动孢子诱导方法，在V8 培养基上连续光照培养可以诱导产生大量的游动孢子［19］。在此基础上，本研究分析光照强度、温度、相对湿度和pH 变化对胡椒瘟病菌产孢的影响，为认识胡椒瘟病成灾机制和建立针对性病害防控措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及保存

胡椒瘟病菌（P. capsici）分离自海南省万宁市胡椒病株，由本研究室近期分离鉴定，室温保存于PDA斜面试管中。

1.1.2 培养基

诱导胡椒瘟病菌产孢所用的培养基为10% V8蔬菜汁琼脂（V8-A）培养基，配制方法如下： 将V8 蔬菜汁在5 000 g 条件下离心5 min，取上清液100 mL，加入CaCO31 g、琼脂粉20 g，用去离子水定容至1 000 mL，调节pH 至7.0，分装后于121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 不同环境条件下胡椒瘟病菌游动孢子诱导

将胡椒瘟病菌接种在V8-A平板中央，用锡纸包裹避光，在26℃条件下黑暗培养7 d 后解除锡纸；用无菌玻璃棒轻轻涂压菌丝使其贴附于平板表面，在恒温光照培养箱（珠江牌，LRH-800-GSI Plus）中诱导产孢48 h，每个平板加入无菌水10 mL，先4℃恒温1 h 后再26℃恒温1 h，使游动孢子充分释放；在此基础上，将“在恒温光照培养箱中诱导产孢48 h”阶段设置不同的光照强度、温度、相对湿度、pH 等环境条件处理，检测不同条件对胡椒瘟病菌游动孢子产量的影响。所有试验均设置3个重复。按环境因子分别将各试验处理介绍如下。

1.2.1.1 光照强度

共设置6 个处理，光照强度分别为黑暗处理、200、2 000、5 000、10 000 和 20 000 lx。其中黑暗处理用双层锡纸包裹；光照条件通过恒温光照培养箱设置，用照度计（Spectrum，3414FQF）确认平板放置位点的实际光照强度，当光照强度无法达到设定值时添加适量的白光LED灯补光。按照6 个不同光照强度进行游动孢子诱导，其他试验条件均为26℃、pH7.0、密封平板内自然湿度。

1.2.1.2 温度

共设置5个处理，温度分别为15、20、25、30和35℃。温度条件通过光照培养箱（珠江牌，LRH-800-GSI Plus）进行设置。培养箱内实际温度通过温湿度计（OMEGA，OM-HL-SH-TH）进行确认。按照5个不同温度条件进行游动孢子诱导，其他试验条件均为光照强度5 000 lx、pH7.0、密封平板内自然湿度。

1.2.1.3 湿度

共设置5 个处理，相对湿度分别约为50%、65%、85%、95%和99%。无菌环境的湿度条件通过以下方法获得：在容量为1 L 的烧杯中加入800 mL蛭石后用封口膜封口，以121℃灭菌30 min 后放入90℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥24 h，在超净工作台中分别加入无菌水0、75、150、300、600 mL，置于26℃恒温24 h，使用温湿度计（OMEGA，OMHL-SH-TH） 检测烧杯中空气湿度分别约为50%、65%、85%、95%和99%；在超净工作台中将待诱导产孢的平板去除上盖，放入烧杯中的蛭石上，封口后放入光照培养箱中，在5 000 lx、26℃、pH 7.0条件下诱导游动孢子。

1.2.1.4 pH

共设置7 个处理，pH 值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0。将磷酸氢盐缓冲液（gibco，1×PBS）加无菌水稀释10 倍，使用pH 计（Mettler-Toledo ， SevenCompact S210） 调节pH至各梯度值，形成7 种不同pH 的处理液；分别向待诱导产孢的平板中加入10 mL 处理液浸泡菌丝，以形成不同的pH环境，在5 000 lx、26℃、液体环境条件下诱导游动孢子，后期不再加入无菌水。

1.2.2 游动孢子产量调查

将产孢平板中液体轻轻摇晃均匀，吸取20µL滴加在血球计数板（XB-K-25）上，轻轻盖上盖玻片，置于奥林巴斯IX73 显微镜载物台上，用10×40 倍视野进行观察。每个平板制作3 个临时装片，每个装片统计中央大方格四角处4个方格内的游动孢子总数（n100），根据公式计算游动孢子浓度［12］：游动孢子浓度（个/mL）＝n100×4×104。

1.2.3 数据处理

所有数据均采用SPSS 16.0 软件进行分析处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），费雪最小显著差异检验（Fisher’sleast-signifi‐cant difference test，LSD）（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 光照强度对游动孢子产量的影响

结果显示，在其他因素一致的情况下，光照强度对胡椒瘟病菌游动孢子产量影响很大（图1）。随着光照强度在0～20 000 lx 逐步增强，胡椒瘟病菌游动孢子产量呈抛物线趋势。黑暗条件下不产生游动孢子，随光照增强产孢量迅速上升；在5 000 lx条件下产孢量达到顶峰，为1.10×106个/mL，分别是 2 000 和 10 000 lx 条件下的 6.89 倍和 12.40 倍；在10 000 lx条件下产孢量仅有8.89×104个/mL，与20 000 lx 条件下的产孢量无显著性差异（p＜0.05）。

2.2 温度因素对游动孢子产量的影响

结果显示，在其他因素一致的情况下，温度条件变化能够明显影响胡椒瘟病菌游动孢子产量（图2）。在15～35℃培养条件下，均能诱导胡椒瘟病菌产生游动孢子，其产量随温度上升呈抛物线趋势。在25℃条件下的产孢量最高，达1.11×106个/mL；抛物线在顶点左右基本对称，在20和30℃条件下也能产生大量游动孢子，分别为5.82×105和7.29×105个/mL；在15 和35℃条件下的产孢量远低于其他温度条件，处于1×104个/mL 水平。除了15 和35℃2 个处理之间的产孢量差异不显著之外，其他所有处理间均存在显著性差异（p＜0.05）。

2.3 湿度因素对游动孢子产量的影响

结果显示，在其他因素一致的情况下，相对湿度因素对胡椒瘟病菌游动孢子产量具有一定的影响（图3）。随着相对湿度在50%～99%逐步上升，胡椒瘟病菌游动孢子产量呈先略微上升再明显下降的趋势。相对湿度在50%和60%条件下，产孢量分别为1.01×106和1.16×106个/mL，但二者间差异不显著；随湿度上升游动孢子产量呈显著下降趋势；99%湿度条件下的产孢量低于95%湿度条件，但差异不显著（p＜0.05）。

2.4 pH因素对游动孢子产量的影响

结果显示，在其他因素一致的情况下，环境pH 变化对胡椒瘟病菌游动孢子产量影响较大（图4）。随着pH 在4.0～10.0 逐步上升，胡椒瘟病菌游动孢子产量呈先升后降的抛物线趋势。pH 6.0～8.0 时产孢量较高，其中pH 7.0 的产孢量最高，为5.14×104个/mL；过酸（≤pH 5.0）或者过碱（≥pH 9.0）的环境中游动孢子产量均迅速下降。

3 讨论与结论

3.1 讨论

众多研究表明，辣椒疫霉在黑暗条件不产生游动孢子，光照是诱导产孢的重要前提条件。但是，侯全刚［14］、王晓敏等［15］和李立凤等［16］研究发现，持续光照比间歇式光照更有利于辣椒疫霉产生游动孢子，并未计量光照强度。何烈干等［20］、刘裴清等［21］和兰成忠等［22］研究认为，诱导辣椒疫霉产孢的光照强度分别为2 000、800 和500 lx不等。本研究首次分析了不同光照强度对胡椒瘟病菌游动孢子产量的影响，发现5 000 lx光照强度下胡椒瘟病菌游动孢子产量最高，该光照强度远高于上述研究中的光照强度。需要注意的是，胡椒瘟病菌虽然属于辣椒疫霉，但是其在遗传学系统发育树上与来源于温带的辣椒、茄子等温带作物上的辣椒疫霉分属不同的分类亚群［18］，推测来自热带的胡椒瘟病菌最适光照强度高于来自温带的辣椒疫霉。另外，阴雨天气室外的光照强度范围是50～500 lx，晴天室外光照强度范围是10 000～100 000 lx。所以推测，自然环境中阴雨过后至天气转晴前这段时间的光照条件最适合胡椒瘟病菌产生游动孢子。

国内外报道中，诱导辣椒疫霉产生游动孢子的温度条件通常为 25～28℃［1，9-13，15-16］，但也有例外，侯全刚［14］发现分离自青海线椒上的辣椒疫霉在30℃时产孢量最高［14］。本研究发现，胡椒瘟病菌最适产孢温度是25℃，在20～30℃均能产生大量游动孢子，该最适产孢温度与当前国内外普遍选用的游动孢子诱导温度一致。桑利伟等［2-3］报道称，中国胡椒主产区海南省胡椒瘟病周年均可发生，4月和10月是病害发生高峰期，该地区周年温度条件中，2～12 月份平均温度均在20～30℃，仅1月份平均温度略低（约18℃），2个发病高峰期的月平均温度均约为26℃。由此推测，胡椒瘟病在海南周年均可发生可能与全年温度均较适合产孢有关，病害发生率与游动孢子产量可能呈正相关关系。

对于辣椒疫霉产生游动孢子的湿度条件，国内外多采用环境自然湿度或者室内培养时平板内的自然湿度［1，9-16］，尚未见关于环境湿度对产孢量影响的研究，这可能与建立无菌恒湿的环境条件难度大有关。本研究尝试向无菌烧杯里加入不同比例的干燥蛭石和水以建立不同湿度梯度的无菌环境，发现在恒温条件下不同处理的烧杯中，空气相对湿度呈现较为稳定的湿度梯度。基于此装置，本研究首次分析了空气湿度对胡椒瘟病菌游动孢子产量的影响，结果发现，在50%～99%的湿度范围内，胡椒瘟病菌均有较高的产孢量（≥2.27×105个/mL），其中相对湿度较低 （50% 和65%）时的产孢量显著高于高湿度条件（≥85%），说明胡椒瘟病菌可能偏好在较为干燥的环境中产孢。

本研究发现，环境条件为pH 7.0 时，胡椒瘟病菌游动孢子产量最高，这与侯全刚［14］报道一致。此外，本研究为了创建不同pH 梯度的产孢环境，在诱导产孢平板上加入了不同pH 的PBS 缓冲液浸泡菌丝，但是获得的游动孢子产量最大仅为5.14×104个/mL，远低于其他3 种因素试验中的最大产孢量（约1.0×106个/mL），说明磷酸缓冲液浸泡不利于胡椒瘟病产生游动孢子。

3.2 结论

研究结果表明，光照强度、温度、相对湿度、pH 等环境因素均对胡椒瘟病菌游动孢子产量具有显著影响，胡椒瘟病菌产生游动孢子最适宜的环境条件约为：光照强度5 000 lx、温度25℃、相对湿度65%、pH 7.0。