miR-10b对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及机制*

张雪莲， 吴维宇， 何峰

(成都医学院第一附属医院 消化内科， 四川 成都 610500)

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在中国的发病人数约占全球的40%[1]，提示中国人群具有胃癌高风险性。近年来，虽然胃癌的治疗效果有所提高，但是进展期胃癌患者的生存率仍不理想，多数患者就诊时已发展至中晚期，导致干预滞后。因此，寻找有效胃癌分子标志物，尽早诊断胃癌，对于改善患者预后至关重要。随着表观遗传学研究的深入，发现胃癌的发生发展与很多复杂基因和信号通路有关[2-4]。miRNA作为一类内源性非编码单链小RNA，在进化过程中高度保守的特点，且参与多种生物学过程，可通过不同的调控途径影响细胞的增殖和凋亡[5-6]。miR-10是近年来肿瘤研究领域的热点分子，已被证实与多种肿瘤的发生发展密切相关[7-8]，但是其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响还有待进一步研究。本研究采用荧光定量PCR方法，检测了20例胃癌患者癌组织及癌旁组织中miR-10b的表达，探讨其与胃癌细胞增殖和凋亡之间的相关性及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 标本采集和主要试剂

2018年12月确诊的20例胃癌患者，男13例、女7例，年龄31～65岁、中位年龄49岁，取胃癌组织标本和配对的癌旁正常组织标本(距癌组织约5 cm)，立即采用液氮冻存，-80 ℃保存。人类胃癌细胞株：高分化AGS、中分化N87、中分化SGC-7901、低分化MKN-45、低分化BGC-823和正常胃黏膜上皮细胞GES-1细胞系均购自中国科学院上海细胞库。DMEM(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青)，Trizol提取试剂 (Invitrogen公司)，青霉素、链霉素和DMSO(Gibco BRL公司)， MTT(碧云天)，AnnexinV/PI细胞凋亡试剂盒(武汉谷歌科技公司)，Lip2000转染试剂盒和Taqman mRNA反转录试剂盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和转染 胃癌细胞常规培养于含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的培养基中，于37 ℃，5%CO2孵箱中培养，2 d换液1次，3 d传代1次。将miR-NC(阴性对照物)和miR-10b转染至对数生长期的人胃癌细胞系MKN-45细胞中，按Lip2000转染试剂盒所提供的方法操作，转染24 h后将细胞正常培养，24 h后换液继续培养至48 h。

1.2.2胃癌组织和细胞中miR-10b及上皮型钙黏蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)检测 取癌组织以及癌旁组织研磨粉碎后，加入Trizol提取总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行质量控制和浓度测定，确定D260/D280比值在1.7～2.0，参照Taqman mRNA反转录试剂盒说明书进行逆转录反应合成cDNA；以 GAPDH 或U6为内参， 使用扩增试剂盒对 cDNA 进行扩增。反应条件为预变性94 ℃、10 min、1个循环、扩增反应95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，30个循环。以2-△△ct计算相对表达量，完成 PCR 。取5株不同分化程度的胃癌细胞株，根据其不同分化程度分为三组，即高分化组(AGS)、中分化组(N87、SGC-7901)、低分化组(MKN-45、BGC-823)，以胃黏膜上皮永生化细胞GES-1为正常对照组，检测不同分化组细胞中miR-10b和E-cadherin的表达(检测步骤同上)；在人胃癌细胞系MKN-45细胞分别转染miR-10b siRNA阴性对照物后，检测细胞内E-cadherinmRNA水平表达。反转录引物miR-10b F为5′-TACCCTGTAGAACCGAATTGTG-3′，R：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′，以U6为内参，反转录引物为R：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAAATATGGAACTGC-3′；F：5′-GGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。E-cadherin： F：5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′；R：5′-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3′；GAPDH：F：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′；R：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAACT-3′。

1.2.3E-cadherin和凋亡蛋白Bcl2、Bax表达 取癌组织研磨粉碎后、加入裂解液裂解，使用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白，确定浓度后采用SDS-PAGE检测E-cadherin和凋亡蛋白Bcl2、Bax表达量；在MKN-45细胞中分别转染miR-10b siRNA、阴性对照物，在GES-1中转染miR-10b mimics后[9-10]，检测细胞内E-cadherin以及凋亡蛋白表达。

1.2.4MKN-45细胞增殖能力 收集MKN-45对数生长期细胞并转染miR-10b siRNA，阴性对照物为MKN-45对数生长期的细胞转染miR-10b mimics、阴性对照物GES-1细胞后，调整浓度为5×107/L的单细胞悬液，接种于96孔板中，每组设置5个复孔，置于培养箱中24、48 h，终止前每孔加入噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)试剂 20 mL，继续培养4 h，上机前吸弃培养液，每孔加入DMSO 150mL，水平摇床摇动30 min，在酶标仪(570 nm波长)上测量吸光度OD值，计算细胞生长增殖抑制率(IR)=(1-试验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-10和E-cadherin在胃癌组织及癌旁组织中的表达

qRT-PCR结果显示，与癌旁组织比较，胃癌组织中miR-10b的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与癌旁组织比较，胃癌组织中E-cadherin的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：(1)与癌旁组织比较，P<0.05。图1 miR-10和E-cadherin在胃癌及癌旁组织中的表达Fig.1 The expression of miR-10b and E-cadherin in gastric cancer and adjacent tissues

2.2 miR-10b和E-cadherin在胃癌细胞株中的表达

分别以U6和GAPDH作为内标对照结果显示，正常的对照细胞(GES-1)几乎不表达miR-10b，在高分化细胞株AGS和中分化N87和SGC-7901中仅弱表达，但是在低分化的BGC-823、MKN-45细胞株中，miR-10b的表达高于对照细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；相反，E-cadherin在高分化组中表达较高，在中分化组中表达有所降低，而在低分化组中降低最为明显，与对照细胞相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 miR-10b和E-cadherin在胃癌细胞株中的表达Tab.1 The expression of miR-10b and E-cadherin in gastric cancer cell lines

2.3 胃癌细胞MKN-45的凋亡

与MKN-45对照组相比，MKN-45-siRNA组转染miR-10b siRNA抑制miR-10b的表达后，人胃癌细胞MKN-45中E-cadherin的表达升高；进一步在GES-1中转染miR-10b mimics后，与GES-1对照组相比，细胞内E-cadherin表达降低(P<0.05)，提示在MKN-45细胞内，miR-10b对细胞凋亡因子的调控可能是通过影响E-cadherin的表达实现的。见图2。

注： A为在MKN-45细胞内转染miR-10b siRNA抑制其表达后的相关蛋白的表达， B为在GES-1细胞内转染miR-10b-mimics增强其表达后的相关蛋白的表达；(1)与对照组比较，P<0.05。图2 miR-10b对人胃癌细胞MKN-45中E-cadherin表达的影响Fig.2 Effects of miR-10b on E-cadherin expression in human gastric cancer cell line of MKN-45

2.4 miR-10b对人胃癌细胞MKN-45增殖的影响

与MKN-45对照组相比，MKN-45-siRNA组转染miR-10b siRNA 24和48 h，胃癌细胞MKN-45的生长增殖抑制率降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与GES-1对照组相比，在GES-1中转染miR-10b mimics后发现细胞生长增殖抑制率增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 转染miR-10b siRNA 24和48 h后细胞生长增殖抑制率的影响Tab.2 Effects of miR-10b siRNA transfection on cell growth and proliferation in 24 and 48

3 讨论

胃癌作为临床常见疾病，其发病机制繁杂，一直以来是困扰胃癌治疗的瓶颈，目前研究结果显示，胃癌细胞株分化级别与其转移能力呈现负相关，提示低分化的胃癌细胞更易发生恶性转变[11]。因此，尽早的识别低分化胃癌细胞危险标志物，为胃癌可防可治提供了可能性。随着研究的深入，发现胃癌的众多发病机制中，表观遗传学改变可能发挥重要作用。microRNA(miRNA)作为表观遗传学说的重要组成部分，是近些年在真核生物中发现的一类内源性非编码小分子单链RNA，长度约为18～25个核苷酸，具有高度的物保守性。生物体内的miRNA对其靶基因的转录后表达调节气道非常重要的作用，当miRNA和靶向mRNA完全或几乎完全互补时，可导致目的mRNA的降解，而当miRNA和靶向mRNA不完全互补时，则参与负调控翻译过程，阻碍蛋白质翻译[12-13]。miRNA-10b在包括乳腺癌[14-16]、胰腺癌[17-18]等多种肿瘤中的异常表达已有报道，但是对于其在胃癌中的表现还尚不明确。本研究结果显示，不同分化程度的胃癌组织和细胞内miR-10b表达情况存在较大差异，其中在低分化胃癌组织和细胞中，均观察到miR-10b表达明显高于对照组，提示miR-10b作为胃癌细胞低分化异常改变的可疑靶分子具有重要意义，但是其对细胞生物学影响机制仍有待进一步明确。

目前，miRNA参与调控细胞增殖和凋亡异常是最常见，也最显著的生物学功能[19-21]，但所涉机制复杂，E-cadherin是介导上皮细胞间粘附的跨膜糖蛋白，在上皮细胞中均有表达，在细胞外钙因子参与下介导同种亲和性细胞间的粘附。当其表达下调或功能障碍时，将使同种细胞失去黏附，易从原发病灶脱落分离，向局部淋巴结转移或远处转移[22]研究结果显示，在不同分化的胃癌组织和细胞中，高分化组细胞内E-cadherin表达最高，中分化组中表达有所降低，而在低分化组中降低最为显著，提示低分化组易发生转移。

有报道显示，E-cadherin可能是miR-10b的潜在靶基因[23]提示在低分化组胃癌细胞和组织中，E-cadherin的异常低表达可能与miR-10b有关。为此，我们在低分化胃癌细胞中转染miR-10b siRNA抑制miR-10b的表达后，细胞内E-cadherin表达增加，同时，细胞凋亡蛋白表达升高，抗凋亡蛋白表达下降，增殖下降；而在正常对照组中进一步转染miR-10b mimics促进miR-10b的表达后，细胞内E-cadherin蛋白表达下降，同时，细胞凋亡蛋白表达降低，抗凋亡蛋白表达增加，增殖增加。

综上所述，在低分化胃癌细胞株内，miR-10b的异常表达可作为可疑靶标，且异常高表达的miR-10b可影响细胞的增殖与凋亡，而这种调控作用可能是通过影响E-cadherin的表达实现的。