38味中药对猪大肠杆菌的体外抑菌活性

2020-10-21徐倩倩吕素芳张冉冉王怡晴刘青青王艳萍沈志强

中国兽医杂志 2020年5期

徐倩倩，吕素芳，李峰，张冉冉，王怡晴，刘青青，王艳萍，沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州 256600；2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东滨州 256600；3.滨州医学院药学院，山东烟台 264003)

大肠杆菌感染引起的猪病主要有新生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻(PWD)、水肿病(ED)[1]等。随着集约化养猪业的发展，致病性大肠杆菌所导致的仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿病，成为养猪场常发的传染病，也是引起仔猪死亡的重要原因之一，对养猪业造成较大的威胁和重大的经济损失[2]。全国多地都有猪源大肠杆菌多重耐药的报道[3-4]。寻找替代抗生素的治疗或者预防方法成为畜牧业持续稳定发展亟需解决的问题。在我国，利用中药防治腹泻己有几千年的历史，并在防治畜禽疾病中发挥了巨大作用。近年研究显示，中药如黄芩、黄连、黄柏等对猪源大肠杆菌皆有不同程度的体外抑菌效果[5-7]，中药对于大肠杆菌能有效抑菌,临床治愈率为90%之多[8]。因此，本试验的目的是筛选对临床分离多重耐药猪大肠杆菌有抑菌、杀菌作用的中药，并分析部分中药的联合抑菌效果，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 中药材乌梅、茵陈、鱼腥草、连翘、射干、青蒿、知母、薄荷、香薷、苍术、陈皮、石菖蒲、艾叶、黄芪、大黄、黄芩、蒲公英、当归、诃子、五味子、金银花、炙甘草、黄连、板蓝根、山楂、芦荟、大青叶、紫花地丁、苦参、栀子、厚朴、白头翁、秦皮、黄柏、胡黄连、穿心莲、苏木、白芷，均购自山东滨州瑞丰药店，所有药材饮片经鉴定均符合生药质量标准。

药敏纸片7种，阿米卡星[批号：180926，含量：(30±7.5) μg/片]、庆大霉素[批号：180927，含量：(10±2.5) μg/片]、左氟沙星(批号：180922，含量：5 μg/片)、青霉素G(批号：180913，含量：10 U/片)、多黏菌素B(批号：180923，含量：300 U/片)、链霉素(批号：180908，含量：10 μg/片)、阿莫西林(批号：180829，含量：10 μg/片)，均购自杭州市滨和微生物试剂有限公司。

1.2 供试菌株猪大肠杆菌均为临床分离株，由山东省滨州畜牧兽医研究院李峰研究员惠赠；猪大肠杆菌O101：K41(菌株编号为ATCC83707)为标准菌株，由山东绿都生物科技有限公司菌种中心提供。

1.3 培养基、试剂普通肉汤培养基(批号：20160810)，购自青岛市高科园海博生物技术有限公司。普通营养琼脂培养基(批号：160618 14)、M-H肉汤培养基(批号：160321 1)、M-H琼脂培养基(批号：180822 1)，均购自北京陆桥技术有限责任公司。按照说明书操作，高压灭菌后使用。麦氏比浊管(批号：RJ19030)购自温州市康泰生物科技有限公司。

1.4 主要仪器设备 KDM型调温电热套，购自山东甄城华鲁电热仪器有限公司；RZ-52型旋转蒸发仪，购自上海嘉鹏科技有限公司；SHB-B95A型循环水式多用真空泵，购自上海豫康科教仪器设备有限公司；TDL-5-A低速大容量离心机，购自上海安亭科学仪器厂；新华牌LMQ.C型立式灭菌器，购自山东新华医疗器械股份有限公司；300型电热恒温培养箱，购自龙口市先科仪器公司；96微孔板，购自上海拜力生物科技有限公司；SW-CJ医用型洁净工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；8通道微量移液器(10～100 μL)、单道移液器(10～100 μL、100～1 000 μL)，购自Thermo公司；ZD-85恒温振荡器，购自常州国华电器有限公司；BCD-199FD冰箱，购自澳柯玛股份公司；210.3型电子天平，购自上海赛多利斯仪器设备有限公司。

1.5 中药提取液的制备分别取各单味药材大青叶、紫花地丁、栀子、金银花、鱼腥草、青蒿、薄荷、艾叶、蒲公英、穿心莲各30 g，加10倍量水浸润30 min，然后添加到12倍量的水加热煮沸，煮沸后改文火煎煮1 h，过滤，滤渣再加10倍量水煎煮1 h，过滤，取上清，合并2次药液；另外，乌梅、茵陈、连翘、射干、知母、香薷、苍术、陈皮、石菖蒲、黄芪、大黄、黄芩、当归、诃子、五味子、炙甘草、黄连、板蓝根、山楂、芦荟、苦参、厚朴、白头翁、秦皮、黄柏、胡黄连、苏木、白芷，分别各取50 g，加8倍量水浸润30 min，然后添加到10倍量的水加热煮沸，煮沸后改文火煎煮1 h，过滤，滤渣再加10倍量水煎煮1 h，过滤，取上清，合并2次药液，减压浓缩到0.5 g/mL，3 000 r/min离心15 min，取上清，继续浓缩至1 g/mL，105 ℃灭菌20 min，4 ℃保存，备用。

1.6 中药制备液对猪大肠杆菌的体外抑菌效果

1.6.1 菌液的培养试验前将菌种接种到普通肉汤培养基中，置37 ℃恒温培养箱中培养24 h，使其活化，然后挑取典型菌落接种于5 mL普通营养肉汤中，37 ℃培养16～18 h，连续培养2代。第3代置37 ℃恒温摇床中培养4 h左右，使其浊度达到1×106CFU/mL，备用。

1.6.2 纸片法测定常见抗生素对猪大肠杆菌的体外抑菌活性取100 μL细菌培养液，分别接种涂布于M-H琼脂培养基平板，取阿米卡星、庆大霉素、左氟沙星、青霉素G、黏菌素B、链霉素、阿莫西林等7种药物的药敏纸片均匀贴在平板表面，每个平板3种或4种纸片，每种药物重复3次，37 ℃恒温培养24 h后测定抑菌圈直径(mm)。根据美国临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)推荐的标准K-B纸片法判断结果。

1.6.3 中药制备液对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定取灭菌M-H肉汤培养基100 μL分别加入第2孔到第9孔，及第12孔；第1孔、第2孔和第10孔分别加入100 μL待测药液，从第2孔开始依次倍比稀释到第9孔；第1孔到第9孔及第11孔分别加入100 μL菌液，即：第1孔到第9孔的中药制备液浓度分别为(500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9、1.95 mg/mL)，第10孔为药物对照，第11孔为菌液对照，第12孔为肉汤培养基对照，每个试验3个重复，37 ℃恒温培养24 h后取出。从各试验孔中分别取100 μL液体接种涂布于M-H琼脂培养基平板，经37 ℃培养24 h 后观察结果。以菌落分散生长的视为有抑菌效果，此最低浓度值为其MIC值；以肉眼观察无菌落生长为100%被杀灭，此最低浓度值为其MBC值。参考代如意等[9]介绍的判断标准，MIC<7.8 mg/mL为高度敏感，7.8 mg/mL≤MIC≤250.00 mg/mL为中度敏感，MIC>250.00 mg/mL为不敏感。

1.6.4 10味中药联合抑菌试验采用肉汤稀释棋盘法，测定10味中药联合作用时的体外抗菌活性，以各中药对应MIC值的2倍、1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍等浓度分别进行联合药敏试验，重复3次。试验结果以联合抑菌指数(Fractional inhibitory concentration index，FICI)作为联合药敏试验的判断依据：FICI≤0.5为协同作用；0.52为拮抗作用。FICI计算公式如下：

2 结果

2.1 耐药性分析以猪大肠杆菌标准菌株ATCC83707作为对照，发现临床分离大肠杆菌对阿米卡星、庆大霉素、左氟沙星、青霉素G、链霉素、阿莫西林均耐药，仅对多黏菌素B敏感；而标准菌株对青霉素G和阿莫西林耐药，对其他5种常见抗生素均敏感。

表1 临床分离菌株和标准菌株药物敏感性实验结果Table 1 Sensitivity of clinical isolated Escherichia coli and standard strain ATCC83707 to antibiotics

2.2 中药制备水提液对大肠杆菌的体外作用根据7.8 mg/mL≤MIC≤250.00 mg/mL为中度敏感的标准，发现临床分离大肠杆菌对黄连、山楂、芦荟、白头翁、乌梅、香薷、艾叶、黄芩、蒲公英、诃子、五味子、苏木表现为中度敏感，对其他中药表现为不敏感；ATCC83707对黄连、山楂、芦荟、大青叶、白头翁、乌梅、艾叶、诃子、五味子、苏木中度敏感，对其他药物不敏感。

表2 38味中药对临床分离菌株和标准菌株MIC、MBC测定结果Table 2 MIC and MBC of 38 TCMs against clinical isolated Escherichia coli and standard strain ATCC83707 (mg/mL)

2.3 10味中药提取液对临床分离菌株的联合抑菌效果 10味中药提取物对临床分离菌株的体外联合抑菌活性见表3。黄连-芦荟、黄连-诃子、山楂-芦荟、山楂-诃子、山楂-诃子、芦荟-乌梅、诃子-白头翁等联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株呈现协同作用；黄连-山楂、黄连-乌梅、黄连-白头翁、山楂-香薷、芦荟-五味子、乌梅-香薷、乌梅-诃子、黄芩-诃子、诃子-五味子等联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株呈现相加作用；黄连-香薷、黄连-五味子等联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株呈现无关作用；剩余药物联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株呈现拮抗作用。

3 讨论

3.1 中兽药仍然是治疗细菌性疾病的方向细菌的多重耐药问题已成为世界关注的问题，我国也不断减少兽医临床抗生素的用量和品种，逐渐寻找抗生素的替代产品。中兽药具有的天然独特优势促使其理所当然地成为良好备选之一。对比临床分离多重耐药大肠杆菌和标准对照菌株，抗生素作用显示出极大差别，临床分离菌株仅对多黏菌素B敏感，对其他受试抗生素均表现耐药，而标准菌株对大部分抗生素表现敏感，说明抗生素的可用范围正在减小；而对比中兽药，临床分离菌株对黄连等12味中兽药中度敏感，标准菌株对10味中兽药中度敏感；2种菌株均对黄连、山楂、芦荟、白头翁、乌梅、艾叶、诃子、五味子、苏木表现为中度敏感，这与一些报道的结果也是一致的[10]。香薷、黄芩、蒲公英临床分离菌株敏感，而对标准菌株不敏感，说明中兽药抗菌作用目前还未受到细菌耐药与否的影响，因此中兽药仍然是治疗细菌性疾病的方向。

3.2 中兽药的开发利用还有很长的路要走在试验过程中，最初选择了牛津杯法、纸片法，但一些问题限制了上述2种方法的应用：成分复杂，有的成分影响药物在琼脂中的扩散，例如牛津杯法测定黄柏的抑菌效果时，黄柏本身的黏稠性使其难以扩散，影响结果观察；中兽药提取液中含有使纸片硬化的成分，一些中兽药做成纸片后，药物扩散不出。最终我们选择的微量2倍稀释法结合平板法，避免了颜色和杂质对结果判定的影响。

相比西药，我们发现中兽药有一定的抑菌效果，但其有效药物浓度远高于西药，在临床应用时受到很大限制，也有一些中兽药通过进一步分离提取纯化达到了较好的效果，例如黄芩苷对大肠杆菌的MIC为16 μg/mL[11]。还有另外一种可能就是中兽药作用的方式存在多靶点的特点，在抑菌的同时还有抗炎、抗氧化、改变离子流动等其他作用途径[12-13]，具体的作用机制及用药方式还需要进一步研究。

表3 中药对临床分离大肠杆菌的联合抑菌活性Table 3 FICI of sensitive TCM combination to clinical isolated Escherichia coli

3.3 联合用药后效果差别大七情配伍是中药用药基础，本试验中，黄连-芦荟等7对联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株呈现协同作用，可理解为相使配伍；黄连-山楂等9对中药联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株呈现相加作用，可理解为相须配伍；黄连-香薷、黄连-五味子等联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株呈现无关作用，可单独用药；其余27对药物联合应用时，对临床分离大肠杆菌菌株均呈现拮抗作用，可理解为相恶配伍。在文献报道中，复方中药不同配伍对临床分离株大肠杆菌也呈现了不同的敏感性[14]。因此，在中兽药临床用药中，在研究单味药作用的同时，联合用药的药效研究也是必不可少的。

3.4 一株菌不具有普遍意义大肠杆菌多重耐药的现状是逐渐演变而来的，基因组也发生了不同的改变，因此，1株菌对中兽药的敏感性只能给出一点提示，而不能代表全部，本试验中临床分离大肠杆菌对黄连MIC为250 mg/mL，对黄芩MIC为62.5 mg/mL，而文献报道中黄连对猪大肠杆菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径19 mm，远高于黄芩11.6 mm[15]。因此，在研究过程中，还需要扩大临床细菌样本量，筛选效果稳定的，对各种菌株均具有抑菌效果的中药。