6种中药醇和水提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果评价

王悦尚，赵亚楠，翟云逸，张庭华，姜胜男，杨 燕，王 慧

(1.临沂大学药学院，山东 临沂 276000；2.华中农业大学动科动医学院，湖北 武汉 430070；3.临沂大学农林科学学院，山东 临沂 276000；4.临沂市农业科学院，山东 临沂 276012)

目前，由于抗生素滥用带来的细菌耐药性、环境污染以及动物源性食品安全问题日趋严重[1-2]，如何寻找安全、高效、绿色、无污染的抗生素替代品是广大兽医工作者亟待解决的问题。天然中草药因具有毒性低、抗菌范围广、不易产生耐药性、价格低廉等优点而成为研究的焦点[3]。本试验以天然中草药甘草、黄连、板蓝根、黄芩、黄芪、大青叶等为研究对象，研究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果，为寻找兽医临床中细菌性感染天然治疗药物提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 WK-800A高速药物粉碎机(青州市精诚机械有限公司)；RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHK-Ⅲ循环水式多用真空(郑州科泰实验设备有限公司)；优谱超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SHP-160生化培养箱(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)；SW-CJ-1D单人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2 药物 板蓝根、黄连、黄芩、黄芪、甘草、大青叶(临沂康宇中药饮片有限公司)。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(中国兽医药品监察所)。

1.4 方法

1.4.1 中药水提取物的制备 各药材经粉碎机粉碎后，取粗粉30 g，置于1 000 mL圆底烧瓶，并加入600 mL蒸馏水浸泡2 h，煮沸回流2 h，趁热用纱布过滤，得一次提取液；圆底烧瓶加入600 mL蒸馏水煮沸回流2 h，趁热用纱布过滤，得二次提取液；将2次提取液合并，用旋转蒸发仪(80 ℃、160 r/min)，浓缩提取液达原体积1%时，将浓缩液倒至培养皿中置于电热恒温鼓风干燥箱恒温干燥(温度70 ℃)，3 d 后可得中药水提取物的干燥物。

1.4.2 中药醇提取物的制备 方法同2.1，区别在于本提取方法以乙醇作为溶剂，提取各药材的醇提物，并制备母液。

1.4.3 中药提取物工作液配制 称取中药水提取或醇提物干燥粉末0.4 g加入10 mL离心管，加蒸馏水配制浓度为40 mg/mL母液，超声溶解，并经0.22 μm无菌微孔滤膜过滤除菌，密封，放4 ℃冰箱备用，于试验开始前将母液稀释至所需浓度。

1.4.4 细菌活化及菌落计数 取灭菌试管，加入肉汤培养基，用接种环钩取大肠杆菌放入肉汤培养基，放生化培养箱(37 ℃)培养16～24 h。选取活化的大肠杆菌菌悬液，采用试管10倍浓度递减稀释法稀释菌悬液，依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。从10-3～10-8对应浓度的试管中各取100 μL分别涂布营养琼脂培养基上，放入生化培养箱37 ℃培养16～24 h，计算菌落个数。根据稀释浓度推算菌悬液的活菌数[4]。金黄色葡萄球菌活化及菌落计数方法同大肠杆菌。

1.4.5 药敏试验 将18～20 mL营养琼脂培养基倒入已灭菌培养皿中，水平静置，凝固后在平板底部平均分成3个区域(5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL)，分别标记5、10、20，平皿外部标记菌种、提取方式、药物名称。取107CFU /mL的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌100 μL 涂布到平板上，3个区域中心各放1个牛津杯，将各对应浓度的无菌药液200 μL加入牛津杯中，放生化培养箱37 ℃培养18～24 h，观察药物对金黄色葡萄球菌或大肠杆菌有无抑菌圈，并用游标卡尺量取抑菌圈直径(mm)。

根据抑菌圈直径，确定药物对细菌的敏感程度，判定标准见表1。

表1 药物敏感试验判定标准Table 1 Determination criteria of drug sensitivity test

1.4.6 最低抑菌浓度(MIC)试验[5]取11支试管，每管加1 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基，第1支试管加入1 mL 20 mg/mL的药液，采用试管2倍稀释法稀释至第9支试管，试管中药物浓度依次为10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04 mg/mL。1～10支试管各加入100 μL的105CFU/mL菌液，第11支试管加入100 μL无菌生理盐水，前9支试管作为试验管，第10支试管为细菌对照，第11支试管为阴性对照。放生化培养箱37 ℃培养16～24 h，观察细菌生长情况，以无细菌生长的药物最低稀释浓度为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。

1.4.7 最低杀菌浓度(MBC)试验[5]根据药物醇和水提取物的MIC，将未见细菌生长的各试验试管摇匀后分别吸取100 μL加入到营养琼脂培养基上，涂布均匀，放入生化培养箱37 ℃培养16～24 h后用活菌计数法检查平皿上的菌落，菌落数小于5个的视为无细菌生长，以无细菌生长的最低浓度作为该药物的最小杀菌浓度(MBC)。

2 结果

2.1 不同中药提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的药敏试验

2.1.1 中药水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的药敏试验 试验结果表明，大青叶、板蓝根、甘草、黄连、黄芪、黄芩水提物对大肠杆菌无抑菌作用，对金黄色葡萄球菌，仅黄连水提物表现较强的抑菌作用，并且随着药物浓度的增加，抑菌效果增强，浓度在5～20 mg/mL时对金黄色葡萄球菌均表现极敏，结果见表2。为探明黄连水提物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌效果，故又进行了0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL黄连水提物对金黄色葡萄球菌的药敏试验，结果表明，0.5～2 mg/mL黄连水提物对金黄色葡萄球菌也表现极敏，结果见表3。

表2 不同中药水提物对检测菌的抑菌圈直径Table 2 The inhibition zone diameters of different Chinese medicine water extracts on the detected bacteria

表3 黄连水提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的药敏试验Table 3 Sensitivity test of water extracts of Rhizoma coptidis to E.coli and S.aureus

2.1.2 中药醇提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的药敏试验 大青叶、板蓝根、甘草、黄连、黄芪、黄芩醇提物对大肠杆菌无抑菌作用，对金黄色葡萄球菌，仅黄连醇提物表现较好的抑菌效果，并且随着药物浓度的增加，抑菌效果逐渐增强。黄连醇提物浓度在5～20 mg/mL时对金黄色葡萄球菌均表现极敏，结果见表4。为探明黄连对金黄色葡萄球菌的最佳抑菌浓度范围，故又进行了0.5 mg/mL、1 mg/mL 和2 mg/mL 黄连醇提物对金黄色葡萄球菌的药敏试验，发现0.5～2 mg/mL黄连醇提物对金黄色葡萄球菌表现高敏，见表5。

表4 不同中药醇提物对检测菌的抑菌圈直径Table 4 The inhibition zone diameters of different Chinese medicine alcohol extracts on the detected bacteria

表5 黄连醇提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的药敏试验Table 5 Sensitivity test of alcohol extracts of Rhizoma coptidis to E.coli and S.aureus

2.2 黄连醇和水提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度 黄连水提物对金黄色葡萄球菌MIC结果表明，药物管1～9支试管均未出现浑浊，为确定黄连水提物对金黄色葡萄球菌的MIC，故对药物进行了2次稀释，结果发现，黄连水提物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.04 mg/mL。黄连醇提物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.08 mg/mL。结果见表6。

表6 黄连醇水提取物对金黄色葡萄球菌MICTable 6 Determination of the minimal inhibitory concentration(MIC) of Rhizoma coptidis alcohol and water extracts on Staphylococcus aureus

2.3 黄连醇和水提取物对金黄色葡萄球菌最低杀菌浓度 黄连水提物第9个平板长有金黄色葡萄球菌，而第8个平板没有菌落。由此得出黄连水提取物对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC)为0.08 mg/mL。而黄连醇提取物第8个平板长有金黄色葡萄球菌，而第7个平板没有菌落，由此得出黄连醇提取对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC)为0.16 mg/mL。

3 讨论

6种中药醇和水提取物中仅黄连醇提物和水提物对金黄色葡萄球菌表现较强的抑菌效果，浓度在0.5 mg/mL时，黄连醇提物和水提物对金黄色葡萄球菌分别达高敏和极敏。黄连醇提物和水提物对金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.08 mg/mL和0.04 mg/mL，MBC结果显示，黄连醇和水提取物对金黄色葡萄球菌均表现杀菌作用，MBC分别为0.16 mg/mL和0.08 mg/mL。本次试验表明，黄连醇水提物对金黄色葡萄球菌抗菌活性明显，且其水提物抑菌效果优于醇提物，这可能与不同提取方式获得有效成分的不同有关[6]。

卢肖英等[6]研究表明，黄连不同炮制方法，对金黄色葡萄球菌的抗菌效果不同，其中生黄连对金黄色葡萄球菌的抗菌效果最好，MIC为0.6 mg/mL。李俊超[7]等发现，黄连水提物对Sa5金黄色葡萄球菌株抑菌效果最好，MIC为0.008 g/mL；而黄连醇提物Sa4、Sa5金黄色葡萄球株抑菌效果最好，MIC为0.008 g/mL。王瑞君等[8]也研究了黄连水提物对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。综合目前针对黄连提取物对金黄色葡萄球的抗菌效果评价，本试验获得的黄连醇和水提物，对金黄色葡萄球的最低抑菌浓度均优于前人相关研究，这可能与药材来源与产地、提取工艺等因素有关。此外，张颖颖等[9]研究表明，黄连提取物与黄芩以2∶1比例混匀后，对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌效果更好。这表明，黄连与其他中药配伍，可能获得更好的抑菌效果。通过从传统中药组方中寻找黄连相关方剂，筛选组方中各有效成分，进行配伍及抑菌试验，获得对金黄色葡萄球菌效果最优的中药组合物，可能是我们下一步需要探究的问题。

黄连中含有的生物碱(如小檗碱、黄连碱、巴马亭、表小檗碱)抗菌活性较强[10-12]。其中异喹啉类生物碱小檗碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌具有显著抗菌活性，其发挥抗菌作用的机制与干扰细菌蛋白质的合成有关[13-14]。通过本次试验表明，黄连醇和水提取物对金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌作用，且其水提物抑菌效果优于醇提物。下一步还需明确黄连提取物中哪些成分发挥了抗菌作用，其作用机制如何，是否对其他微生物也有抗菌作用等问题。