多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

石盼盼 谢文佳 刘燕 王璐 陈蕾 郝莉花

摘要：采用多重实时荧光PCR技术，对大豆筛选基因35S启动子（cauliflower mosaic virus，CaMV 35S）、NOS终止子（nopaline synthase，NOS）和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针，在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上，摸索引物组合和扩增条件，最终确定合适的探针引物组合和试验条件，建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强，灵敏度高，可用于大豆转基因成分的快速检测，大大提高检验效率，可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。

关键词：三重实时荧光聚合酶链式反应PCR;大豆;转基因成分;特异性;灵敏度

中图分类号：S565.101 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）18-0077-04

收稿日期：2019-11-12

基金项目：河南省科技攻关计划（编号：172102310724）。

作者简介：石盼盼（1987—），女，河南洛阳人，硕士，工程师，主要从事食品安全质量检测研究。E-mail：523150920@qq.com。

大豆营养丰富，为人类提供优质的蛋白质和油脂，是我国重要的粮食油料兼用作物，也是重要的饲料来源[1-2]。我国大豆及相关产品的消费量在国际上一直名列前茅。以2017年为例，我国消费大豆油1 740万t，占全球消费总量的309%;消费豆粕7 407万t，占全球消费总量的317%。随着健康饮食方式的引导，大豆消费水平不断上升，但国内种植量增长缓慢。近几年来，我国主要从美国、阿根廷等国家进口大豆[3-4]。在进出口贸易中大豆及其产品转基因成分是常检项目。转基因大豆产品因其安全性备受争议，严重影响了人们对大豆的消费热情。目前，市场监督管理及进出口检验检疫部门着重于研究开发更为科学高效的转基因大豆检测技术，保证非批准转基因大豆及其产品无法进入我国[5]。

我国农业农村部已经批准美国孟山都等公司的多种转基因大豆进口到我国。我国自主研发的转基因大豆品种也已经实现产业化。我国转基因育种技术的发展进一步促使基因产品检测技术的发展升级[6]。目前我国国家标准中对转基因大豆的检测主要以聚合酶链式反应（PCR）法为主。如《农业部2630号公告-15-2017转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种定性PCR方法》[7]和国家标准GB/T 33526—2017《转基因植物产品 数字PCR检测方法》[8]。在研究领域多种基于分子生物学的检测技术不断涌现，但应用性方面还有待研究推广[9-14]。其中，魏霜等利用多重串联式PCR基因碟片技术用于转基因大豆GTS40-3-2的检测[15]，即利用多重PCR和巢式荧光定量PCR检测GTS 40-3-2的多个外源基因和内源基因，实现了转基因的高通量检测，但该方法技术要求高，且检测方法主要是普通PCR技术，检测结果须要进一步凝胶电泳分析，过程相对复杂。本试验研发的三重实时荧光PCR法可以达到多项国家标准和进出口行业标准的基因检测限，并且1次反应能同时准确检测有无转基因大豆的CaMV 35S、NOS和Lectin 3个基因片断，试验时间短，操作简单，方便技术推广应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

大豆转基因成分阳性质控样品、大豆转基因成分阴性质控样品，均购自中国检验检疫科学研究院测试评价中心;实时荧光PCR扩增引物和探针（表1），均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（体积比为25 ∶24 ∶1）、2×PCR MasterMix，均购自北京索莱宝科技有限公司;试验用水取自笔者所在实验室 Milli-Q 超纯水系统的二级水;其他无水乙醇等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水系统，购自密理博中国有限公司;HFsafe生物安全柜，购自上海力申科学仪器有限公司;LightCycle480荧光PCR仪，购自罗氏诊断产品有限公司;Colibri Titertek Berthold超微量分光光度计，购自上海科瑞生物科技有限公司;移液器，购自美国Eppendorf公司;高通量组织研磨器，购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA的提取

酚三氯甲烷抽提法：称取50 mg粉状样品至1.5 mL离心管中，加入 700 μL DNA提取裂解液，置65 ℃水浴3 h，其间不时振荡混匀;12 000 r/min离心5 min，转移上清至新的 1.5 mL 离心管中，加入等体积苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（25 ∶24 ∶1），充分混匀后，12 000 r/min 离心5 min;取上清，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠溶液，混匀后加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20 ℃静置3 h，12 000 r/min离心5 min弃去上清;加70%乙醇洗涤1～2次，通风柜内室温下晾干，加50 μL TE缓冲液，最终获得D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之间的DNA溶液。

1.3.2 引物和探针的设计

在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库查找并拷贝转基因大豆常用外源基因CaMV 35S啟动子/NOS终止子及内源基因Lectin的序列，使用NCBI的在线引物设计功能和生工生物工程（上海）股份有限公司的引物通过在线设计软件设计出针对这3个基因的正向引物、反向引物和荧光探针。分别使用荧光基团FAM、Cy5和HEX作为发光基团，使用TAMRA、BHQ3和TAMRA作为淬灭基团。设计的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 引物及探针特异性测试试验

分别用以转基因大豆阳性质控样品及阴性质控样品的DNA为模板，按照以下反应体系进行反应：灭菌蒸馏水 3.4 μL、2×PCR Master Mix 10 μL、正向引物（1 μmol/L）1.8 μL、反向引物（1 μmol/L）1.8 μL，探针（0.25 μmol/L）2 μL、DNA模板（50 ng/μL）1 μL，总体系20 μL。反应程序：50 ℃预变性15 s，95 ℃预变性1 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，变性延伸过程进行45个循环。退火结束时采集探针对应的单重荧光，进行单重实时荧光PCR试验，检测3个基因对应的引物及探针的特异性。每个基因扩增设置阳性样品、阴性样品、空白对照，各设2个重复。阳性试验以转基因大豆阳性质控样品DNA为模板，阴性试验以转基因大豆阴性质控样品DNA为模板，空白对照以无菌水作为扩增模板。

1.3.4 三重荧光PCR反应体系及程序

在各基因单重PCR检测对应引物探针特异性良好的基础上，摸索合适的引物配比和试验条件，进行三重实时荧光PCR试验，最终三重荧光PCR检测体系见表2，扩增程序优化结果如下：95 ℃预变性15 s;95 ℃ 变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，变性延伸过程进行45个循环。退火结束时采集探针对应的三重荧光即FAM、HEX和CY5采集信号，每个基因扩增设置阳性样品、阴性样品、空白对照，各设2个重复。阳性试验以转基因大豆阳性质控样品DNA为模板，阴性试验以转基因大豆阴性质控样品DNA为模板，空白对照以无菌水为扩增模板。

1.3.5 三重荧光PCR检测体系的灵敏度试验

将转基因大豆阳性质控样品和转基因阴性玉米样品以质量1 ∶9混合均匀，以“1.3.1”节的方法提取DNA， 再10倍逐级稀释使阳性DNA占1%、0.1%。然后以大豆转基因阳性质控样品DNA和阳性占比为10%、1%、0.1%的质控样品DNA为模板，按“13.5”节三重荧光PCR反应体系及程序进行PCR扩增，每个模板设置2个重复，观察扩增情况，记录各DNA的扩增循环数（CT）。

2 结果与分析

2.1 引物探针特异性检测结果

2.1.1 CaMV 35S基因扩增用引物和探针特异性检测结果

如图1所示，只有以转基因大豆阳性质控样品DNA为模板时才有特异性扩增，2个平行样品的CT值为分别为23.61、24.55，而其他样品DNA没有扩增。说明设计合成的大豆转基因CaMV35S启动子检测用引物和探针特异性良好，没有交叉反应。

2.1.2 大豆内源Lectin基因扩增用引物和探针特异性检测结果

如图2所示，当以转基因大豆阳性质控样品和阴性质控样DNA为模板时才有特异性扩增，2个平行样品的CT值分别为23.61、24.55和27.03、26.69。而非大豆样品DNA和空白对照DNA均没有扩增。说明设计合成的大豆内源基因Lectin检测用引物和探针特异性良好，没有交叉反应。

2.1.3 NOS终止子基因扩增用引物和探针特异性检测结果

如图3所示，只有以转基因大豆阳性质控样品DNA为模板时才有特异性扩增，CT值分别为28.14、28.02，而其他样品DNA没有扩增。说明设计合成的大豆转基因NOS终止子检测用引物和探针特异性良好，没有交叉反应。

2.2 三重实时荧光PCR体系扩增图结果

如图4、图5、图6所示，三重体系中阳性样品各基因均有典型的“S”形扩增，阴性样品除Lectin基因外其余都没有扩增，试剂空白和提取过程空白均没有扩增。说明建立的三重PCR体系扩增特异性良好，体系成立。

2.3 多重PCR体系的灵敏度测定

由图7、图8、图9、表3可知，构建的三重扩增体系中CaMV 35S基因、Lectin基因和NOS的检测灵敏度均可以达到样品质量浓度的0.1%。

3 结论

本研究利用多重荧光PCR的优势，建立了可同时检测转基因大豆启动子35S、终止子NOS和内源基因Lectin的三重实时荧光PCR方法，可以通过1次PCR实现对大豆样品的转基因初级筛查。特异性和灵敏度检测证明该方法可用于大豆样品的转基因检测，大大提高了检测效率，操作过程简单宜于推广，对进一步促进分子生物学技术在检验检测领域的应用有一定的推动作用。但该方法中NOS在三重体系中显示检测荧光值偏低，可能与CY5荧光值较弱有关，该体系也有待进一步优化，在不同品牌PCR仪间的适用性问题也有待进一步验证。

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