番茄Mi-1基因调控元件及同源基因进化分析

刘子记 刘维侠 牛玉 杨衍

摘要：为阐明Mi-1基因转录调控元件及同源基因进化特点，从番茄品种京番308中克隆Mi-1基因起始密码子上游序列，选取转录起始位点上游1 432 bp的序列进行启动子顺式调控元件分析，分析结果表明，Mi-1启动子除了含有核心元件外，还含有光响应元件、脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件等。Mi-1同源基因进化分析结果表明，Mi-1同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。当同源指数为0.70时，番茄、马铃薯、辣椒中含有Mi-1同源基因，与辣椒相比，番茄与马铃薯的亲缘关系更近。结果可为进一步研究 Mi-1基因的调控表达和进化规律奠定基础。

关键词：番茄;根结线虫抗性;启动子;同源基因;基因進化;顺式调控元件

中图分类号： S436.412文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）18-0066-06

收稿日期：2019-09-20

基金项目：海南省科技项目（编号：ZDYF2018035）;中国热带农业科学院基本科研业务费专项（编号：1630032017027）;农业农村部财政专项（编号：NFZX2018）。

作者简介：刘子记（1982—），男，山东菏泽人，博士，副研究员，主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail：liuziji1982@163.com。

通信作者：杨 衍，博士，研究员，主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail：catasvegetable@163.com。

根结线虫（Meloidogyne spp.）病是农作物最常见的病害之一，根结线虫环境适应性强，在世界各地均有分布，寄生范围广，可侵染3 000多种植物[1]。南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫是发生最为普遍的4种线虫[2]。根结线虫可造成作物减产10%～20%，严重时高达75%以上[3]。另外，根结线虫还能与真菌和细菌形成复合侵染，加剧土传病害的发生，造成更加严重的经济损失[4-5]。据估计，世界范围内每年由根结线虫造成的损失超过1 200亿美元[6]。

番茄（Solanum lycopersicum）是易感根结线虫的作物，根结线虫侵染番茄根系后，会造成番茄株高和产量显著降低，果实品质变差[7-8]，已成为番茄产业发展的主要障碍[9]。以往防治根结线虫主要采用轮作、化学防治等方法。轮作具有较大的局限性，在特定地区无法达到合理轮作的要求[10]。采用化学防治方法对土壤进行消毒，不仅会降低蔬菜品质，严重破坏土壤生态系统[11]，而且会导致线虫抗药性增强，虫口密度上升[12]。培育抗病品种是防御番茄根结线虫病最为经济、有效的方法[13]。1956年Gibert研究发现，秘鲁番茄对根结线虫的抗性由1个显性基因Mi控制，Mi基因被定位在番茄第6号染色体的短臂端[14]。Kaloshian等采用图位克隆的方法从野生番茄中分离到Mi基因[15-16]。之后研究人员相继发现了9个抗根结线虫基因[17]，抗性位点Mi被表示为Mi-1。Mi-1基因是目前被开发利用最为广泛的抗根结线虫病基因[18]，能有效抵抗南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种主要根结线虫的侵染[19]。植物对根结线虫的抗性表现为过敏性反应，当根系受到根结线虫侵染时，被侵染部位周围的植物组织内发生细胞坏死，从而限制根结线虫的取食和抑制其生长发育，最终致使根结线虫死亡[20]。Mi-1基因抗性机制还有很多方面未被揭示，有关Mi-1启动子特征和同源基因进化的研究鲜有报道。因此，本研究拟克隆Mi-1基因的上游启动子序列，分析顺式调控元件，另外，基于同源指数构建系统进化树和基因进化折线图，旨在为进一步阐明Mi-1抗性机制和促进其有效应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为京番308，属于粉果番茄杂交种，早熟，无限生长型，绿肩，果实圆形，每穗坐果数4～6个，单果质量80～120 g，耐裂性好，汁多味浓，具有Mi-1、Tm2a等基因位点，由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。试验于2018年8月在中国热带农业科学院儋州试验基地进行，将供试番茄种子播种于育苗盘中，待长至4叶1心时，摘取叶片，采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[21]提取番茄材料的基因组DNA。

1.2 方法

1.2.1 Mi-1启动子序列克隆

为了获得Mi-1启动子序列，参照GenBank中的Mi-1编码序列AF039682和番茄基因组序列（https：//solgenomics.net/），根据Mi-1基因起始密码子下游600 bp内的序列利用软件Primer 5.0设计引物（正向引物序列5′→3′：CTGCAAAGTTTCTCCGCTTAT，反向引物序列5′→3′：CAAAATCGGAATAAGAAAGC），以京番308叶片基因组DNA为模板进行扩增，目的条带的回收采用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，将目的条带进行连接、转化，筛选3个阳性克隆，委托英韦创津生物科技有限公司进行测序。

PCR反应体系包括6 μL Premix TaqTM，150 ng模板DNA和1 μmol/L引物，添加ddH2O补足 10 μL。扩增程序为95 ℃预变性4 min;94 ℃变性50 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，40个循环;72 ℃ 终延伸 8 min;PCR产物最后于4 ℃下保存。取10 μL扩增产物与 2 μL Ultra Power DNA染料和2 μL上样缓冲液混合均匀，经1%琼脂糖凝胶电泳20 min后，显色进行带型分析。

1.2.2 Mi-1启动子序列分析

Mi-1基因转录起始位点利用在线软件FGENESH进行预测。Mi-1 启动子顺式调控元件利用P1antCARE[22]软件进行预测。

1.2.3 Mi-1同源基因系统发育分析

首先通过BLASTP比对确定Gcorn数据库中与Mi-1同源性较高的基因序列，结合BLASTP分析结果，计算基因对之间的同源性指数（HI）。基于HI值对同源基因进行分组，构建系统发育树、基因进化折线图和同源基因在物种相关网络中的分布图。

2 结果与分析

2.1 Mi-1基因启动子克隆

为了获得Mi-1启动子序列，根据Mi-1起始密码子下游600 bp内的序列利用软件Primer 5.0设计引物，以京番308叶片基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得大小为2 045 bp的序列，经与 Mi-1 编码序列比对发现，其位于1 523 bp处，起始密码子ATG下游編码序列与Mi-1编码序列相匹配，说明所克隆序列为Mi-1基因上游启动子序列。采用在线软件FGENESH预测Mi-1转录起始位点位置，结果发现，转录起始位点位于1 435 bp处（A），位于起始密码子上游338 bp处。选取转录起始位点上游1 432 bp序列进行启动子区域顺式作用元件预测。

2.2 Mi-1基因启动子序列分析

利用P1antCARE软件分析Mi-1基因启动子序列，结果（图1、表1）发现，Mi-1基因启动子序列中存在多个顺式作用元件。除了含有TATA-box、CAAT-box等核心元件外，还发现多个光响应元件，如AE-box、ATC-motif、Box 4、G-box、GATA-motif等;植物激素响应元件，如脱落酸响应元件ABRE;防御与胁迫响应元件，如TC-rich repeats;茉莉酸甲酯响应元件，如CGTCA-motif和TGACG-motif;低温诱导元件，如LTR。预测结果说明，该启动子的表达可能受光、脱落酸、逆境胁迫、低温和茉莉酸甲酯等的诱导。

2.3 Mi-1同源基因进化树构建

由于Gcorn数据库无Mi-1基因序列，为了进行Mi-1同源基因进化分析，首先利用NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）基于Mi-1基因序列AF039682.1进行同源比对，结果显示，与番茄XM_004240451.4的序列一致性最高，达9539%，XM_004240451.4对应的基因ID为101 244 292，对应的蛋白质ID为XP_004240499.1，利用XP_004240499.1基于Gcorn数据库进一步开展 Mi-1 同源基因进化分析。基于XP_004240499.1和与其同源性最高的20条蛋白质序列构建Mi-1同源基因系统发育树。结果（图2）表明，XP_004240499.1 与番茄XP_010321826同源性最高，同源性指数为1.00，与潘那利番茄 XP_015078201 的同源性指数为0.93，与马铃薯 XP_015160128 的同源性指数为0.80，与辣椒 XP_016575993 的同源性指数为0.71。同源基因进化分析结果表明，番茄中Mi-1同源基因与马铃薯中Mi-1同源基因的亲缘关系较近，其次为辣椒。

2.4 Mi-1同源基因进化分析

为了简化系统发育树的特征，构建Mi-1同源基因进化折线图。当同源指数为1.00时，共包括2条蛋白序列，属于旁系同源基因。同源指数为093时，潘那利番茄和普通番茄含有Mi-1的同源基因，同源基因属于直系同源基因。同源指数为081时，

潘那利番茄、普通番茄和马铃薯含有Mi-1同源基因，同源基因属于直系同源基因（图3）。在物种相关网络（图4）中，节点代表物种，蓝色节点代表该物种包含Mi-1的同源基因，当同源指数为0.70时，潘那利番茄、普通番茄、马铃薯、辣椒含有Mi-1的同源基因。综上所述，茄科作物番茄、马铃薯和辣椒中含有Mi-1的同源基因，同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。

3 讨论与结论

随着保护地番茄栽培面积的增大以及复种指数的增加，根结线虫危害日趋严重[23-24]。番茄Mi-1基因是目前被广泛开发利用的抗根结线虫病基因。Mi-1调控元件的不断发现及同源基因系统进化的深入研究，将有助于揭示抗病基因在发挥抗性过程中的调控方式。启动子含有转录起始所需的保守序列和RNA聚合酶特异性结合位点，是调控基因表达的重要组成部分。本研究选取番茄抗根结线虫 Mi-1基因转录起始位点（TSS）上游1 432 bp的序列作为启动子序列进行顺式调控元件分析，分析结果显示，该启动子除含有CAAT-box和TATA-box等核心作用元件外，还含有多个光响应元件。

Tameling等研究发现，Mi-1具有结合和水解ATP的活性[25]。由于ATP是植物在有光条件下，通过光反应过程合成的，推测光对于诱导和调控 Mi-1 的基因表达具有重要作用。

另外，Mi-1启动子区域还含有茉莉酸响应原件，这与Cooper等的研究结果[26]一致，Cooper等的研究结果表明，Mi-1介导的根结线虫抗性在32 ℃时有所降低，茉莉酸处理可以增强高温下Mi-1介导的根结线虫抗性[26]。Mi-1启动子区域含有胁迫响应元件，这与Guo等的研究结果[27]相吻合，Guo

等的研究表明，厌氧胁迫可以增强番茄材料的水杨酸信号通路[27]。水杨酸信号通路对于诱导Mi-1基因产生对根结线虫的抗性具有重要作用[28]。另外，本研究还发现，Mi-1启动子区域含有脱落酸响应元件，进一步推测Mi-1基因受激素和胁迫的诱导表达。

Mi-1同源基因系统进化分析结果表明，番茄、马铃薯和辣椒中存在多个Mi-1同源基因，尤其番茄中最多，这可能是由基因重复和基因转换引起的，这与Segura等的研究结果[29-30]一致。番茄 Mi-1 同源基因编码的蛋白XP_004240499.1与马铃薯Mi-1同源基因编码蛋白的同源指数高于辣椒，进一步说明与辣椒相比，番茄与马铃薯的亲缘关系更近，这与基于基因组序列构建的物种间相关关系一致（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy）。Mi-1 同源基因在潘那利番茄、普通番茄、马铃薯、辣椒中既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。这可能是由Mi-1同源基因在基因组上常成簇存在，基因拷贝间发生频繁的序列交换引起的，这与Sanchez-Puerta等的研究结果[31]一致。本研究结果表明，Mi-1同源基因在茄科作物基因组进化过程中发生过多次基因复制与基因转换事件。

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