一株青枯菌拮抗细菌M26的筛选、鉴定及其发酵条件优化

陈丹丹，李圆圆，齐素敏，冉新炎，韩广泉，陶宁，王丽荣

（山东碧蓝生物科技有限公司／泰安市植物微生态制剂重点实验室，山东 泰安 271000）

番茄（Solanum lycopersicum L.）是管状花目茄科番茄属一年或多年生草本植物，为我国主要的蔬菜之一。番茄营养丰富，其含有的番茄红素具有抗氧化、清除自由基、延迟衰老和抗癌的功效［1］，具有很大的经济效益。随着番茄种植面积的不断扩大，番茄青枯病也越来越严重。番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种常见的维管束系统性病害之一，发病严重时可造成植株死亡，导致番茄严重减产甚至绝收［2］。

利用生防菌防治番茄土传病害是一种有应用前景的防治措施［3］。芽孢杆菌（Bacillus）是一类研究较多的生防细菌，当前用于防治青枯病的芽孢杆菌有解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）［4-6］、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）［7，8］、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）［9］、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）［10］、耐寒短杆芽孢杆菌（Brevibacterium frigoritolerans）［11］、特基拉芽孢杆菌（B.tequilensis）［11］、多 粘 芽 孢 杆 菌（Paenibacillus polymyxa）［12］等。美国迄今已有1个解淀粉芽孢杆菌FZB42和3个枯草芽孢杆菌GB03、MB1600、QST713获得商品化生产许可［13］。

本试验筛选到一株抑制青枯雷尔氏菌的细菌M26，通过16S rRNA基因序列、形态学和生理生化特征分析，确定其为解淀粉芽孢杆菌，并对其发酵条件进行优化，为开发该菌株成为青枯病生防菌提供参考，同时丰富了防治青枯病的微生物资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：青枯雷尔氏菌，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心；其他菌株由山东碧蓝生物科技有限公司菌种保藏中心保存。

供试培养基：芽孢培养基（YB）：葡萄糖2 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化钠5 g，水1 L，pH＝7.0，固体培养基（YA）加琼脂粉15 g；青枯培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，酵母提取物0.2 g，牛肉提取物3 g，氯化钠0.5 g，七水硫酸镁1.5 g，水1 L，pH ＝7.0，固体培养基加琼脂粉15 g和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）100μL；2%营养琼脂培养基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，水1 L，pH值为7.2～7.4，琼脂粉20 g，1%NA培养基加琼脂粉10 g。所有培养基121℃灭菌30 min备用。

主要试剂和仪器：葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯化钠等，均为分析纯试剂；天根细菌基因组DNA提取试剂盒；PCR引物，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成；HBI芽孢杆菌生化鉴定条，由青岛海博生物技术有限公司生产；BIO-RAD PCR仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；OLYMPUS CX31型显微镜，日本奥林巴斯株式会社；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；TANON-1600全自动数码凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌的初筛 菌液的制备：将青枯菌接种于青枯液体培养基中，30℃、180 r／min摇床培养48 h后备用；将保存的拮抗菌接种到YB培养基中，37℃、180 r／min摇床培养24 h后备用。

初筛方法：采用平板孔扩散法。底层为20 mL的2% NA培养基，待培养基凝固后加入1 mL的青枯菌和5 mL的1% NA培养基摇匀，等液体干透后用打孔器（直径9 mm）距离中心3 cm打4个孔，每孔中加100μL的生防菌液，每个处理重复3次，抑菌圈直径按十字交叉法进行测量。

1.2.2 拮抗菌的复筛 从初筛结果中选取抑菌效果比较好的菌株进行复筛，方法如1.2.1，选出抑制效果最好的1株细菌。

1.2.3 拮抗菌的鉴定 利用细菌DNA提取试剂盒提取拮抗菌DNA，使用细菌16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：DNA模板2 μL，Mix 25μL，27F 1μL，1492R 1μL，ddH2O 21 μL。PCR扩增程序：95℃4 min；94℃30 s，52℃80 s，72℃90 s，30个循环；72℃8 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序，测序后的拼接结果在NCBI上进行BLAST相似序列检索比对，采用MEGA 6.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统进化树。

形态学和理化特征试验：将拮抗菌接种于YA培养基中，37℃培养24 h，观察菌落形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度等，并进行革兰氏染色和芽孢染色［14］，具体方法参考《常见细菌系统鉴定手册》［15］。

1.2.4 发酵条件优化 （1）种子液制备：将复筛得到的拮抗菌接种至YB培养基中，37℃、180 r／min培养24 h待用。

（2）发酵条件优化：按照1／15（V／V）的接种量接种于YB培养基培养24 h，分别检测不同温度（25、30、35、45、55℃）、不同pH值（5、6、7、8、9）、不同NaCl含量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、不同转速（150、180、210 r／min）、不同装载量（15%、25%、40%、50%）下600 nm的光密度值，每个试验组设3个重复。

1.3 数据处理

采用SPSS软件包单因素方差分析法（oneway ANOVA）中的Duncan’s多重比较检验法进行数据分析和差异显著性检验（P＜0.05），利用Microsoft Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的筛选

选取保存的40株菌进行纯化，编号为M1、M2、… 、M40。有5株细菌对青枯雷尔氏菌有较强的抑制作用，抑制结果如表1所示。其中菌株M26对青枯雷尔氏菌具有很强的抑制作用，抑菌圈直径达14.34 mm，复筛平均抑菌圈直径达15.22 mm。经过连续多次试验后抑菌效果稳定（图1），所以对菌株M26进行进一步研究。

表1 5株细菌对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径 （mm）

2.2 M26菌株16S rRNA基因序列分析

电泳结果（图2）显示，PCR产物长度在1 500 bp左右。测序结果显示M26菌株16S rRNA基因的序列长度为1 453 bp，与电泳结果一致。M26与Bacillus amyloliquefaciens strain BA31（MG548650）相似性达到99.79%。系统进化树也显示M26与B.amyloliquefaciens strain BA31（MG548650）在同一系统分支上（图3）。因此，初步鉴定M26为解淀粉芽孢杆菌。

图1 M26菌株对青枯雷尔氏菌的抑制效果

图2 M26菌株16S rRNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

图3 基于16S rRNA基因序列构建的M26及相关菌株的系统发育树

2.3 菌株M26的形态和生理生化特征

菌株M26在YA培养基上37℃培养24 h后，菌体呈杆状，有荚膜和芽孢；菌落为乳白色，呈圆形，直径在0.35～0.45 cm，表面有褶皱，中心部分凸起，边缘为锯齿状，不透明，不产生色素。部分生理生化特征见表2，与B.amyloliquefaciens的生理生化特征［16，17］最为接近。

表2 M26菌株的生理生化特征

2.4 菌株M26的发酵条件优化

由图4可知，菌株M26在25～55℃范围内均能生长，25℃和35℃的差异不显著，但是在25℃时生长最好（图4 A）；在25℃条件下，M26在pH值5～9范围内均能生长，在pH＝7下生长最好（图4 B）；在25℃、pH＝7条件下，M26在NaCl含量为0～2%的条件下均能生长，0.5%NaCl含量下生长最好（图4 C）；在25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量下，180 r／min下OD600显著低于150 r／min和210 r／min，在150 r／min条件下生长最好（图4 D）；在上述优化条件下，装载量为40%下生长的最好（图4 E）。综上可知：解淀粉芽孢杆菌M26在25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量、转速为150 r／min、40%装载量条件下生长的最好。

图4 不同发酵条件下菌株M26的生长情况

3 讨论与结论

解淀粉芽孢杆菌可通过产生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物质抑制植物病原菌、真菌、病毒和线虫［18-20］。其易于生产，对环境友好，是一类重要的生防资源［21］。有研究表明：解淀粉芽孢杆菌对番茄青枯菌有很强的拮抗作用［22，23］；枯草芽孢杆菌、解淀粉杆菌和地衣芽孢杆菌能够抑制青枯病的发生，且枯草芽孢杆菌抑菌能力最强，可使感染率降低80%［24］；解淀粉芽孢杆菌BS2004、SQY162和SQRT3对番茄青枯病的防治效果在70%以上，最高可达到81.25%，且均能够促进番茄植株生长［25-27］。

解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的亲缘性很高，对人体及其它生物无害，因此被广泛应用于饲料、植物病害防治及果蔬保鲜中［28］。本研究对菌株M26的发酵温度进行优化时，在45℃生长最差，而在35℃和25℃均生长良好。符可芯等［17］的研究表明，解淀粉芽孢杆菌在高于45℃时菌体生长放缓，OD值下降，且在55℃的OD值高于25℃的，与本研究结果不一致，可能是解淀粉芽孢杆菌菌株的差异性所造成的。刘芳等［21］的研究表明，随着温度的升高，枯草芽孢杆菌BZJN1的芽孢数减少，45℃时降到最低，与本研究结果一致。

通过分析M26菌株的16S rRNA序列、形态和生理特征，确定M26为解淀粉芽孢杆菌。M26菌株的最佳培养条件为温度25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量、转速150 r／min、装载量40%。本试验为解淀粉芽孢杆菌的生产工艺提供了参考数据。