奥曲肽治疗TNBS致大鼠溃疡性结肠炎及其机制研究

朱 锐，何 灵，唐 瑶，白 杰

(新疆医科大学药学院药理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种常见的肠道性疾病，在临床上主要表现为腹痛、腹泻以及粘液脓血便等。此病的发病机制尚不明确，目前已知主要受遗传基因的易感性、免疫受损和环境因素等联合导致的肠道粘膜炎症反应有关。临床上治疗UC的常见药物为水杨酸、糖皮质激素类，这类药物缺乏特效性，毒副作用较大，因此无法长期使用[1]。越来越多的研究表明，细胞因子在发病机制中起着关键作用，其中促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子之间的平衡失调被认为是UC的重要发病机制之一。2，4，6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonicacid，TNBS)是一种有机酸半抗原物质。可进入肠道，其结构中的三硝基苯基残基能与肠组织高分子组织蛋白以共价形式结合，改变表面蛋白质，从而形成自身抗原，使肠道内激活针对自身抗原的迟发性超敏反应，进而诱发结肠炎的发生[2]。奥曲肽(Octreotide)是一种人工合成的化合物，能有效的缓解水电解质失衡症状，抑制胃液，肠液等消化液分泌, 奥曲肽还具有与生长抑素相似的作用，可以抑制消化液分泌、肠胃蠕动，缓解结肠炎患者腹痛、腹泻、呕吐的症状[3]。因其较天然生长抑素具有半衰期长，使用方便，价格便宜等优点，常用于辅助治疗溃疡性结肠炎。本课题组前期研究表明[4]，隐孢子虫感染建立的肠易激综合征小鼠模型经腹腔注射奥曲肽(50 μg·kg-1·d-1)后，可通过降低生长抑素受体4(somatostatin receptor 4，SSTR4)和SSTR5的表达，改善肠易激综合征。因此，本实验拟以TNBS诱导SD大鼠建立UC模型后，研究奥曲肽对UC的治疗作用及作用机制，为奥曲肽用于UC临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠♀♂各半、体质量(180～220) g,由新疆医科大学实验动物中心提供，使用许可编号：SYXK(新)2018-0003，SPF级环境下适应性喂养7 d。

1.2 实验试剂醋酸奥曲肽注射液，诺华制药，批号：S0512；柳氮磺胺吡啶(SASP)肠溶片，上海信谊天平药业有限公司，批号：09170629； ELISA试剂盒,上海钰博公司；PI3K、AKT1、p-AKT1抗体，免疫组化试剂盒，均购自Elascience公司；3%过氧化氢、PBS缓冲液粉末、柠檬酸钠粉末、DAB染色液、苏木素染液、中性树胶，均购自中杉金桥；无水乙醇，富宇试剂；生理盐水，四川科伦药业有限公司；戊巴比妥钠粉剂，金鑫天佑公司；TNBS，Sigma公司，批号：P2297；4%多聚甲醛，索莱宝公司。

1.3 实验仪器全自动酶标仪，Multikan GO,Thermo公司；Nano Drop核酸定量仪，Thermo公司；高速低温离心机，MULTIFUEGX-3R, Thermo公司；37 ℃水浴锅，常温切片机医用微波炉，显微镜，染色缸，盖玻片。

1.4 主要溶液的配置

1.4.1TNBS灌肠溶液 将无水乙醇用蒸馏水稀释成浓度为50%的溶液，再用5% TNBS与50%乙醇等体积混匀，存入4 ℃冰箱避光保存。

1.4.2阳性药灌胃液 柳氮磺胺吡啶肠溶片给药量为0.4 g·kg-1，研细后溶于3 mL 0.9%生理盐水中,现配现用。

1.5 动物分组以及模型的制备70只SD大鼠，采用完全随机分组法，将大鼠分为4组：正常对照组16只、模型(TNBS)组22只、奥曲肽给药组16只、阳性给药组16只。70只SD大鼠造模前禁食不禁饮24 h，操作前，先将大鼠刺激排便并记录体质量，根据体质量注射戊巴比妥钠，待其麻醉后，用涂抹液体石蜡的医用聚乙烯管缓慢插入大鼠肛门，深度9～10 cm，正常对照组等体积0.9%生理盐水灌肠，其余3组均给予TNBS/乙醇灌肠液灌肠，灌肠后捏紧肛门保持倒悬体位30 s，之后保持肛门高位5 min防止药物流出，放置在笼中，自由进食、水。

1.6 致病性的确定在TNBS诱导24 h以后，随机处死模型组6只大鼠，3%戊巴比妥钠麻醉后取结肠病变部位，用4%多聚甲醛溶液固定，常温放置48 h后取2 cm左右用于石蜡包埋，HE染色。观察诱导部位及严重程度，确定UC大鼠模型是否建立成功。

1.7 症状、体征观察及评分每日观察大鼠进食、饮水、皮毛以及活动状态的变化，称量体质量，观察粪便性状，有无便血。进行疾病活动指数(DAI)评分。根据肉眼观察结肠外观形态，是否存在肠粘连，进行结肠粘膜大体病变(CMDI)评分。在显微镜下随机观察HE染色切片5个不同的视野，进行结肠组织病理(TDI)评分。

1.8 HE染色及组织病理学观察分离结肠，采集标本，取病变明显处约2 cm的结肠组织，4%多聚甲醛固定、常规脱水，包埋切片后，进行HE染色，在显微镜下观察肠粘膜损伤情况。

1.9 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及PLA2按照ELISA试剂盒说明书检测组织匀浆中的IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及PLA2含量水平。

1.10 免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)按照试剂盒操作进行免疫组化染色。在光镜下每个切片至少采集5个不同的视野图像，使用Image Pro Plus软件根据IOD值，比较AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表达水平。

1.11 Real time-PCR检测结肠PI3K、AKT mRNA水平称取100 mg大鼠结肠组织提取RNA，测定总RNA浓度及纯度，逆转录为cDNA后于-20 ℃保存。根据NCBI Geenbank查找基因序列，使用NCBI Primer BLAST功能对产物进行验证，合格基因序列由生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见Table 1。依据2-ΔΔCT法计算mRNA的表达。每个样本均为2复孔，总反应体系为20 μL，反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，57 ℃ 34 s。根据样本CT值进行相关计算，根据熔解曲线判断PCR产物是否具有特异性。

Tab 1 Primer sequences used for PI3K and AKT1 detection with real time-PCR

2 结果

2.1 奥曲肽对UC大鼠DAI评分的影响实验期间，正常组大鼠饮食正常，毛发有光泽，活跃度较高，无腹泻、便血现象。其余3组在TNBS诱导24 h后均出现不同程度饮食量下降，稀便、肉眼可见血便，活跃度降低等。如Tab 2所示，与正常对照组比较，模型组评分升高，差异具有显著性(P<0.01)。奥曲肽给药组于给药d 2后稀便、软便渐停，饮食、活动均有所增加，与模型组比较，具有统计学意义(P<0.05)。d 3奥曲肽给药组明显好转，与模型组比较，差异具有显著性(P<0.01)与阳性药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明奥曲肽与阳性药相比，能在早期对UC起到治疗作用。

2.2 奥曲肽对UC大鼠结肠粘膜以及CMDI评分的影响末次给药后次日，正常组大鼠结肠粘膜光滑润泽，肠壁纹理清晰，不增厚，肠道无粘连，未见充血、水肿、糜烂及溃疡。模型组SD大鼠结肠可见大面积溃疡形成，溃疡周围水肿、充血，肠腔扩张增粗，肠壁增厚，部分大鼠出现肠道之间或结肠与周围组织如腹膜等严重粘连，病变处发生增生，病变部位内残留大量粪便，粪便不能通过，沿肠系膜纵剖结肠，生理盐水冲洗干净后可见明显黑色结痂。模型组CMDI评分，与正常对照组比较，差异有显著性(P<0.01)。奥曲肽给药组结肠溃疡面积明显缩小，充血、水肿消失，肠腔未见粘连，无梗阻发生，沿肠系膜纵剖结肠后未见明显黑色结痂。奥曲肽给药组CMDI评分模型组比较、差异有显著性(P<0.01)。SASP组病变程度有所改善，结肠溃疡面积减少，少数大鼠肠壁可见变厚，肠腔有一处变大或狭窄，与周围组织有轻度粘连。见Tab 3。

Tab 2 Effect of Octreotide on DAI score of UC

Tab 3 Effect of Octreotide on CMDI score of UC

2.3 奥曲肽对结肠病理组织损伤评分(TDI)的影响如Fig 1所示，正常组大鼠粘膜上皮细胞排列整齐紧密，杯状细胞较多，腺体性状未见异常，偶见少量炎症细胞浸润，无充血、溃疡及水肿。模型组镜下明显可见粘模层大量中性粒以及数量不等的嗜酸性粒细胞浸润，可见多处糜烂、溃疡形成，粘膜层缺失，杯状细胞轻度减少，腺体消失，肠道组织结构紊乱，结肠粘膜固有肌层出现增厚现象。模型组TDI评分明显升高，与正常组比较，差异有显著性(P<0.01)。奥曲肽组病变程度明显减轻，主要表现为炎症浸润大量减少，并且炎症浸润仅局限于粘模层，溃疡面积显著减少，腺体修复，肠粘膜组织结构未见明显异常。奥曲肽组TDI评分与模型组相比，差异有显著性(P<0.01)。SASP组镜下可见结肠粘膜固有肌层出现增厚现象，大量中性粒细胞及数量不等的嗜酸性粒细胞浸润，有明显溃疡、糜烂，肠道组织结构紊乱，腺体破坏甚至消失。见Tab 4。

Fig 1 HE-stained colon sections(×100)A：Normal；B：Model；C：Octreotide；D：SASP

Tab 4 Effect of Octreotide on TDI score of UC

2.4 奥曲肽对UC大鼠组织匀浆IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2含量的影响如Fig 2所示，给药7 d后，模型组与正常组相比，组织匀浆中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的表达均明显升高(P<0.01)。与模型组相比较，奥曲肽组大鼠结肠组织匀浆中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的表达均明显降低(P<0.01)。

Fig 2 Change of tissue homogenate levels of IL-1β, IL-6, IL-8, PLA2, TNF-α in **P<0.01 vs normal;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.5 AKT1、p-AKT1、PI3K在大鼠结肠粘膜原位蛋白的表达如Fig 3、4、5所示, 显微镜下观察发现 PI3K、AKT1、p-AKT1蛋白表达在粘膜下层和肠绒毛部位，且均在细胞质表达。与正常组相比，模型组结肠中AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表达明显升高(P<0.01)；给药后，与模型组比较，奥曲肽组结肠AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表达明显降低(P<0.01)；见Tab 5。

Tab 5 Impact of Octreotide on protein expression of AKT1, p-AKT1, PI3K in colonic mucous of UC n=8)

Fig 3 Impact of Octreotide on protein expression of AKT1 in colon of UC ratsA：Normal(×200)；B：Model(×100)；C：Octreotide(×200)；D：SASP(×100).

Fig 4 Impact of Octreotide on protein expression of p-AKT1 in colon of UC rats(×200)A：Normal；B：Model；C：Octreotide；D：SASP.

Fig 5 Impact of Octreotide on protein expression of PI3K in colon of UC rats(×200)A：Normal；B：Model；C：Octreotide；D：SASP.

2.6 PI3K、AKT1在大鼠结肠mRNA的表达水平如Fig 6所示，与正常组相比，模型组结肠中PI3K、AKT1mRNA的表达水平升高(P<0.01)；给药后，与模型组比较，奥曲肽组结肠PI3K、AKT1mRNA的表达降低(P<0.01)。

Fig 6 Expression levels of PI3K and AKT1 mRNA in **P<0.01 vs normal;##P<0.01 vs model

3 讨论

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)以往在欧美多发，但是近几年来，亚洲发病率呈上升趋势，流行病调查资料显示，中国近20年IBD病例数也在迅速增加[5]，且多见于青壮年，因此日益受到重视。现阶段对其病因和发病机制仍不十分清楚，除了与遗传因素、免疫反应异常外，国内外大多数学者研究其具有遗传易感性的人群，发现它与大量肠道细菌有关，并认为是由于肠道细菌的改变导致肠粘膜损伤[6]。不管是肠道的原发性病变还是继发性损害，它们共同表现都包括肠粘膜屏障结构和功能的缺损。而肠粘膜损伤亦是导致IBD发生的主要原因之一，研究发现引起肠粘膜损伤的原因包括炎症因子、免疫异常、肠道菌群失调等因素[7]。其中炎症因子包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、血小板活化因子等[8]。IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子是公认为介导UC形成的重要细胞因子[9]。在IBD的病理生理中，磷脂酶A2作为一种关键酶，介导很多脂质介质的产生，例如类花生酸、溶血磷脂和血小板活化因子[10]。通过本实验研究，我们发现模型组与对照组相比，组织匀浆中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的水平均显著增多，而奥曲肽组能够明显降低IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的水平。结果提示奥曲肽通过抑制促炎因子以及PLA2、TNF-α的产生从而实现了对UC大鼠的肠粘膜保护作用。此结果与其他既往研究中药物对于UC的治疗和有关炎症因子的影响相一致。

核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)作为一种调节各种细胞因子之间的转录因子，在复杂的细胞因子网络失调中，NF-κB的活化是一个关键环节。IBD中NF-κB活性增高的同时伴有IL-1、IL-6、TNF-α等升高，IL-1和TNF-α可促进NF-κB进一步活化，后者通过正反馈使IL-l和TNF-α分泌进一步增加，同时使其他细胞因子IL-6、IL-8等表达增加，产生级联反应，使炎症过程得以持续和放大[11]。

异常信号通路在炎症过程中可导致炎症反应的失调，在IBD中，信号通路与炎症有关的发病机制息息相关[12]。PI3K是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子，能够调节多种细胞功能，例如凋亡、增殖、代谢等, 并在炎症和心血管疾病的发病机制中起重要作用[13]。研究表明， PI3K/AKT信号传导通路也与细胞因子的调控和释放密切相关，如IL-6、IL-8等。此通路被激活后，活化的AKT可以增加NF-κB的磷酸化，减少IκB蛋白合成而激活NF-κB，进而增强细胞促炎因子TNF-α、IL-1β等基因的转录，导致细胞因子IL-6、IL-8等的失衡，进而引起一系列炎性反应和粘膜损伤[14]。本实验结果发现，模型组AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表达量高于正常组，奥曲肽组较模型组明显降低，显示奥曲肽能够阻断PI3K/AKT这一信号通路。国内外多项研究已经证实了PI3K 的活化和PI3K/AKT 信号转导通路参与了小鼠结肠炎和人溃疡性结肠炎疾病的发生发展，而利用 PI3K 抑制剂 wort-mannin 阻断该信号转导通路可以明显减少 NF-κB、TNF-α等细胞因子的产生从而达到抗炎效果[15]。

综上所述，奥曲肽对SD大鼠UC炎症有治疗作用，通过阻断PI3K/AKT信号通路，进而降低促炎因子与PLA2、TNF-α的表达水平，缓解炎症的发生，阻止结肠病理恶化，促进肠粘膜修复。

(致谢：衷心感谢新疆医科大学第一附属医院临床研究院的刘辉老师和新疆医科大学协同创新实验中心的马文静老师对实验提供的帮助和技术支持。)