兰坪乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列扩增及其生物信息学分析

彭超超 ，刘兴能，岳 丹，朱俊红，熊和丽,2，李 静,3，和晓明，席冬梅，邓卫东*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650201；3.公安部昆明警犬基地，云南昆明 650201）

血小板衍生生长因子（Platelet-Derived Growth Factor，PDGF）基因家族及其受体参与血管生成和小鼠性腺中类固醇激素的产生[1]。该基因家族成员——血小板衍生生长因子受体样蛋白（Platelet-Derived Growth Factor Receptor-Like，PDGFRL）是一种与血小板衍生生长因子受体β配体胞外结构域具有显著的序列相似性的蛋白质，由PDGFRL基因编码，在鸡生殖系统中作为类固醇分泌反馈调节机制中的调节器[2-4]。PDGFRL基因是一种肿瘤抑制基因，该基因突变或含有该基因的染色体片段缺失与发散性肝细胞癌、结直肠癌和非小细胞肺癌有关，在个别癌症样本中已发现PDGFRL基因的突变[5-7]。然而，PDGFRL 蛋白具体生物学功能尚不清楚。最近有研究表明，乳腺癌来源的MDA-231 细胞增殖在PDGFRL 过表达时被抑制[4]。前人研究表明，随着黑色素瘤的生长，PDGFRL表达在从非转移性表达水平向转移性表达水平过渡期间有所下降[3]。越来越多的研究表明，PDGFR 在自身免疫性疾病（包括干燥综合征、类风湿关节炎）的发病机制和自身免疫性疾病的小鼠模型（1 型糖尿病、多发性硬化等）中起关键作用，而PDGFRL 对PDGFR信号传导又具有调控作用，故PDGFRL 可能与多种自身免疫性疾病有关[8-12]。黑色素也可以通过限制体外和体内免疫缺陷病毒的生长来增加人体免疫力，色素沉着在免疫系统发育中起着重要作用[13-14]。

2001 年，毛华明等[15]考察兰坪时发现乌骨绵羊，乌骨绵羊毛色与普通绵羊相似，但乌骨绵羊的牙龈是褐色或淡黑色，眼结膜为淡乌色，肛门为乌黑色，对乌骨绵羊解剖后发现其具有乌色的肌肉、骨骼、内脏、气管等性状，并且乌色性状随年龄增大而逐渐加深。由于当地属于铅锌矿的重要产地，起初判断其乌肉特征是由于铅锌中毒导致，但经过检测判断是由于其体内基因作用而形成“乌骨乌肉”特征，并具有遗传现象[16]。兰坪乌骨绵羊是目前世界已知唯一具有乌质性状的哺乳动物，属于珍稀地方品种资源，其主要产地为云南省兰坪县[15]。并且同样的饲养管理条件下，乌骨绵羊体内总抗氧化能力、抗超氧阴离子活力、酪氨酸酶活力、谷胱甘肽过氧化酶等均高于普通绵羊[17-19]。乌骨绵羊体内黑色素含量高，黑色素在人体内可以富集微量元素；黑色素自由基具有光保护作用，避免紫外线对皮肤的伤害；另外，黑色素的抗氧化能力能有效增强人体抵抗力[20-21]，这些作用都将促进乌骨绵羊药用价值和食用价值的发掘。但目前关于乌骨绵羊种质的分子特征研究甚少，对于乌骨绵羊乌质性状相关研究大部分是黑色素生物合成途径及酶调控位点相关基因的研究。本研究通过PCR技术扩增PDGFRL基因编码区序列，对其进行生物信息学分析，从而揭示乌骨绵羊PDGFRL基因的生物学特性，为后续研究PDGFRL 是否会对黑色素细胞的增殖、表达产生抑制或促进以及PDGFRL 和黑色素在对乌骨绵羊免疫作用中是否具有协同作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 实验动物为来自兰坪的兰坪乌骨绵羊25只，使用一次性真空采血管（柠檬酸钠1：9）静脉采血，血样采集后，利用血液基因组DNA 纯化试剂盒提取绵羊血液DNA，保存于pH 为8 的TE 缓存液，置于-20℃条件下备用。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 实验仪器 80-2 台式电动离心机（苏州威尔实验用品有限公司）、LDZX 立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）、DHG 电热恒温鼓风干燥箱（上海习仁科学仪器有限公司）、海尔卧式冷藏冷冻转换柜（青岛海尔特种电冰柜有限公司）、TG16-WS台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器设备有限公司）、XK-400 手掌离心机（江苏新康医疗器械有限公司）、LifeECO 基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）、ESW-ΙV 超纯水系统（上海茸研仪器有限公司）、JEA102 千分之一电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）、美的微波炉（广东美的厨房电器制造有限公司）、DYY-6C 型稳压稳流电泳仪电源（北京市六一仪器厂）、DYCP-31DN 水平式电泳槽（北京市六一仪器厂）、培清JS-780 全自动凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司）等。

1.2.2 实验试剂 蛋白酶K（Merck 原装）、RNase（北京天根生化科技有限公司）、ddH2O（北京天根生化科技有限公司）、无水乙醇（北京化工厂）、漂洗液（北京化工厂）、洗脱液（北京化工厂）、琼脂糖（北京天根生化科技有限公司）、金牌MΙX（昆明硕擎生物技术有限公司）、TAE 缓冲液（北京化工厂）、TE 缓存液（北京化工厂）、ExRed 核酸染料（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）、DL2000 DNA Marker（昆明硕擎生物技术有限公司）等。

1.3 引物设计及合成 根据绵羊26 号染色体（序列号：NC_040277）上的PDGFRL基因序列，利用Premier premier 6.0 软件设计6 对外显子引物，随后在NCВΙ 在线 数 据 库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）进行引物特异性检验，设计好后送至昆明硕擎生物技术有限公司合成PCR 引物。PDGFRL基因6 对引物序列及相关信息见表1。

1.4 PCR 扩增及测序 PCR 反应为25.0 μL 的反应体系，其中含DNA 模板（20 ng/ μL） 1 μL、金牌MΙX（green）22 μL、上下引物（10 μmol/L）各1 μL。多次探究后设定不同引物PCR 反应条件，Exon1-Exon3、Exon5 反应条件：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，退火温度见表1，退火10 s，72℃延伸10 s，30 个循环，72℃后延伸1 min；Exon4、Exon6 反应条件：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，退火温度见表1，退火10 s，72℃延伸10 s，30 个循环，72℃后延伸1 min。PCR 产物经电泳检测后送至昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。

1.5 乌骨绵羊PDGFRL基因序列及其生物信息学分析利用Chromas 软件对所测序列进行人工校对，对于波峰比较好的序列用于下一步分析，然后运用clustalx 软件将所测序列和参考序列进行比对，寻找变异位点，获得开放阅读框；将乌骨绵羊与GenВank 中公布的与其核苷酸编码区序列和相应氨基酸序列相似性较大的人、绵羊、山羊、滇金丝猴、狗、牛、马、猪、鹿、蝙蝠、白鳍豚进行比对分析，利用MEGA-X 软件中的NJ 法重建系统进化树。利用DNAMAN 软件和ExPASy-Translate tool 数据库在线工具进行氨基酸排列组分及蛋白质理化性质分析；利用DNAMAN9.0 软件对PDGFRL 蛋白进行疏水性分析；利用TMHMM Server v.2.0 在线工具对蛋白进行跨膜区分析；利用Signal ΙP 5.0 进行信号肽预测；亚细胞定位预测利用PSORT ΙΙ Prediction；利用NPS@SOPMA 在线工具预测蛋白质二级结构；利用SWΙSS-MODEL 在线工具预测蛋白质三级结构。

2.结果与分析

2.1 PCR 扩增产物分析 如图1 所示，电泳片段清晰明亮且电泳条带清晰无非特异性条带，测序后所得的6 对引物扩增产物片段大小分别为449、802、592、484、462、796 bp，与预期相符。将6 段序列与引物源序列进行比对及序列拼接，获得的序列总长度为1 128 bp。

2.2 乌骨绵羊PDGFRL 蛋白质分析

2.2.1 CDS 序列蛋白翻译 如图2 所示，PDGFRL 蛋白由375 个氨基酸组成，氨基酸组成及含量如图3，预测蛋白质分子质量为41.87 ku，等电点PΙ 为8.93。共发现3 个碱基突变位点（Exon2 上1 个，Exon5 上2 个），碱基突变类型均为同义突变，分别为：G138A、T865C和G893T，没有引起相应氨基酸的变化，3 个变异位点基因型峰图结果如图4。

2.2.2 绵羊PDGFRL 蛋白的分子特征 蛋白质疏水性分析显示PDGFRL基因编码的整段氨基酸序列亲水性区域大于疏水性区域，因此表明PDGFRL 蛋白整体表现为亲水性。TMHMM Server 分析结果显示乌骨绵羊PDGFRL 蛋白没有跨膜区，表明PDGFRL 蛋白不是与膜细胞受体传导有关的膜受体蛋白，不是膜受体蛋白质。Signal ΙP serve 分析结果如图5，SP 值为0.990 3，说明乌骨绵羊PDGFRL 蛋白存在信号肽，推测信号肽位置位于第21 氨基酸序列，属于分泌性蛋白。PSORT ΙΙ Prediction 亚细胞定位预测结果显示PDGFRL 蛋白质在线粒体、细胞质和细胞外等均有分布，主要定位在细胞外。NPS@SOPMA 预测PDGFRL 蛋白二级结构如图6 所示，该蛋白有46 个氨基酸参与α螺旋（H），占总含量的12.27%；有100 个氨基酸参与延伸链（E），占总含量的26.67%；有26 个氨基酸参与β转角（T），占总含量的6.93%；有203 个氨基酸参与无规则卷曲（C），占总含量的54.13%。SWΙSS-MODEL 同源建模乌骨绵羊PDGFRL 蛋白的三级结构，结果如图7。

2.3 乌骨绵羊及部分物种PDGFRL基因核苷酸编码区序列和相应氨基酸序列分析 乌骨绵羊及人、绵羊、山羊、滇金丝猴、狗、牛、马、猪、鹿、蝙蝠、白鳍豚等11 个物种PDGFRL基因编码区核苷酸序列及其编码的氨基酸序列比对结果见表2，其中与绵羊、山羊、牛和鹿等反刍哺乳动物核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源性相对较高，与绵羊的同源性最高，分别达到99.73% 和100%。利用MEGA-X 软件中的NJ 法构建的乌骨绵羊和其他12 个物种PDGFRL基因氨基酸序列分子系统进化树如图8，乌骨绵羊和4 种反刍动物与白鳍豚各自为一类聚在一起，它们和猪又归为一大类；其他5 个物种又归为一大类，滇金丝猴和人聚在一起。

表2 乌骨绵羊与其他11 个物种PDGFRL基因编码区核苷酸序列及其编码的氨基酸序列相似性

3 讨论

迄今为止，有关PDGFRL基因的研究主要集中在人类、鸡和小鼠上面。前人研究表明PDGFRL 有助于维持软骨细胞的增殖，在软骨细胞分化过程中可以抑制其终端分化[4]。Hou 等[22]对PDGFRL突变基因进行SNP 分析揭示PDGFRL基因突变与中国汉族人患贝赛特氏症密切相关。景洋等[23]通过RT-PCR 及免疫组化技术从mRNA 水平上发现PDGFRL基因对蛋鸡卵泡生长发育过程起着重要调节作用。但在绵羊乃至所有反刍动物上仍没有相关报道。本研究首次采用PCR 扩增乌骨绵羊PDGFRL基因外显子序列并对序列进行拼接，获得的开放阅读框总长度为1 128 bp，乌骨绵羊和普通绵羊PDGFRL基因编码区序列同源性达到99.73%，有3 个碱基位点发生同义突变，没有引起相应氨基酸变化，编码由375 个氨基酸序列组成的分泌型蛋白质，其信号肽位置为21aa。这与Guo 等[24]研究结果一致，表明乌骨绵羊可能和人类PDGFRL基因具有同样功能，抑制肿瘤细胞的增殖，促使肿瘤细胞凋亡，在肿瘤抑制网络中发挥重要作用。G138A、T865C 和G893T 3 个突变位点是否会抑制细胞增殖仍需要进一步对突变位点进行多态性分析。

利用NCВΙ 数据库搜索，将乌骨绵羊与不同物种PDGFRL基因编码区核苷酸及其编码的氨基酸序列进行比对发现，PDGFRL基因编码区序列在不同物种间具有高度相似性（>85.65%），说明乌骨绵羊PDGFRL基因编码区在物种进化过程中较为保守。根据12 个物种的PDGFRL基因编码区序列重建系统进化树发现，羊、牛和鹿等反刍动物均为偶蹄目反刍动物亚目聚为一类，它们和猪又归为一大类；其他5 个物种又归为一大类，滇金丝猴和人均为灵长目聚在一起。

在信息学飞速发展的今天，利用生物信息学分析蛋白质的结构已成为当代预测蛋白质结构的趋势[25]。本研究通过生物信息学软件发现乌骨绵羊PDGFRL 蛋白不存在跨膜区，是不属于膜受体蛋白的亲水性蛋白质。空间结构预测表明乌骨绵羊PDGFRL 蛋白主要由β折叠和无规则卷曲构成，三级空间结构表明其存在2 个功能结构域，前人研究表明这2 个功能结构域能有效抑制CT-26 细胞的增殖，诱导其凋亡，并发现PDGFRL 蛋白对某些细胞迁移有影响[26]。PDGFRL 蛋白的表达是否会对乌骨绵羊黑色素细胞的迁移和增殖产生影响还需更加深入研究。

4 结论

本研究结果显示，乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列全长为1 128 bp，编码375 个氨基酸，共发现G138A、T865C 和G893T 3 个同义突变位点；乌骨绵羊与普通绵羊PDGFRL基因编码区核苷酸序列同源性为99.73%；乌骨绵羊PDGFRL 蛋白是一种定位于细胞外的亲水性分泌型蛋白，含有2 个功能结构域。