香菇9608 与一株野生香菇单双杂交及优良杂交菌株筛选

程爽爽，杜双田，张姣，舒斌，高昱昕

（西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌，712100）

香菇（Lentinula edodes）是一种重要的食用菌，在推动国民经济发展、增加农民收入、提高人们生活水平等诸多方面发挥重要作用，特别是在农村精准扶贫的过程中，起到至关重要的作用。为了改善香菇品质，提高香菇产量，人们在香菇新品种选育方面做了大量工作，现有的香菇育种方法有很多，主要包括自然选择、杂交、原生质体融合、诱变、转基因和分子标记辅助育种等，虽然杂交育种耗时较长，但其操作简单，是目前最有效的育种方法之一［1～4］。杂交育种主要有单单杂交和单双杂交2 种方法，单单杂交即2 个不同亲本的单核菌株进行杂交；单双杂交是以待改良的亲本的单核菌株为受体，以提供优良性状相关基因的亲本为供体的杂交方法。单双杂交育种工作现已取得了一定的进展，研发出了申香10 号、申香16 号等香菇品种［2，3］，叶明等研究认为，以野生菌株作为供体菌株，获得的杂交菌株表现出明显的优势［4，5］。

近年来，香菇产业高速发展，现已遍布全国各地，陕西也成为香菇生产大省。虽然我国的香菇育种事业取得了较大的进步，但是适宜在陕西当地栽培的优良香菇新品种却很少。本研究选取陕西本地的香菇主栽品种9608 和野生香菇FP 作为亲本，以野生香菇FP 作为供体菌株，期望通过单双杂交改善9608 的菇形、提高其品质。由于部分杂交菌株会表现出多个性状优于亲本，例如产量较高的菌株可能单菇质量也较大，如何从众多的香菇杂交菌株中筛选出多项性状优于其他菌株的优良新菌株成为杂交选育工作的难点，而且现阶段并没有明确的综合选择体系。本研究测定指标归一化处理，将杂交菌株的多个性状优良状况通过选择指数客观地展现，据此筛选出具有多个优良性状的香菇新菌株，为陕西及周边地区的香菇生产及新品种选育提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

9608：西北农林科技大学保藏，是陕西本地的香菇主栽品种，中低温中熟，高产，但菌柄较长，菌盖较薄、菌盖硬度不大［6］。

FP：由陕西省佛坪县野外采集的野生香菇子实体分离得到［7］，菌柄较短，菇形及品质较好。

1.1.2 培养基

综合PDA 培养基：马铃薯200 g，蔗糖10 g，葡萄糖10 g，KH2PO4，MgSO4，琼脂12 g，酵母膏2 g，蛋白胨2 g，水1 000 mL。

木屑平板培养基：木屑96%，麸皮4%。

常规袋栽培养基：木屑78%，麸皮20%，蔗糖1%，生石膏1%。

1.2 方法

1.2.1 单双杂交

采用钟罩法［8］收集9608 的无菌孢子，以单孢分离法获得单核菌株［9］，筛选优良单核菌株［10］进行单双杂交。将单核菌株与双核菌株转接至综合PDA 培养基上，于25 ℃下对峙培养，二者接触后，继续培养5 d，挑取单核菌落远离双核菌落位置的菌丝培养并保藏。用盖玻片蘸取少量杂交菌株的菌丝，制作水浸片，然后置于40 倍物镜下观察菌丝形态，有锁状联合则为杂交菌株，保存备用；无锁状联合则舍弃。

1.2.2 菌丝生长速率及生长指数测定

制备木屑平板培养基，基质含水率60%左右，每付培养皿中大约装湿料40 g，压实，121 ℃灭菌120 min，冷却后，将杂交菌株定量转接至木屑平板中央，（25±1）℃倒置培养，以十字划线法测量杂交菌株接种后第5 天至第10 天的生长长度，同时根据菌落大小、白度、菌丝旺盛程度等按本实验室评分标准将菌落划分成5 个等级（优良、较好、中等、较差、劣等），从差到优依次给1～5 分，不萌发菌株的长势评分为0。每株菌株重复3 次，杂交亲本为对照。计算生长速率及生长指数［11］。

生长速率/（mm·d-1）=生长长度/生长时间

菌丝生长指数=生长速率×长势评分×1

1.2.3 农艺性状测定

按 常 规 熟 料 栽 培 法 栽 培［8，12］。栽 培 袋 规 格 为330 mm×170 mm×0.07 mm，每 袋 装 湿 料（1.25±0.1）kg，每株菌株重复20～30 袋。试验于2018 年8 月29 日 开 始，2019 年4 月12 日 终 止。

子实体形成时间/d：从接种到第1 个子实体形成的时间，超过149 d 的不再统计；

子实体形成温度/℃：第1 个子实体形成时（能明显区分菌盖与菌柄），前3 d 的平均温度。采用温度自动记录仪，每隔1 h测定1次，最后求其平均值；

每袋产量/（g·袋-1）：试验期内每袋香菇的平均鲜重；

生物学效率/%=每袋产量（g）/每袋基质的风干质量（g）×100；

成菇数量：每袋采收的香菇个数；

单菇质量/g=总产量（g）/成菇数量；

菌盖厚度/mm：菌盖最高点至菌盖与菌柄结合处的长度；

菌盖直径/mm：菌盖外沿的直径；

菌柄长度/mm：自菌柄与菌盖交界处至菌柄底部的长度；

菌柄直径/mm：菌柄中间位置的直径；

菇形指数=菌盖直径/菌柄长度；

菌盖硬度/105Pa：香菇菌盖单位面积承受测力弹簧的压力。采用水果硬度计GY-3 测量香菇的菌盖硬度。测量前保证硬度表头不与工作台接触，即硬度表示数为0。然后将香菇菌盖置于工作台上，使硬度计表头压入香菇内1 cm 时的读数；

每个菌株选取菇形圆整、无病虫害的子实体15～20 个，测定菌盖厚度、菌盖直径、菌柄长度、菌柄直径、菇形指数及硬度。

1.2.4 优良菌株筛选

对测定指标归一化处理，依据市场对香菇形态、品质的要求及栽培实际对不同性状给出相应权重，具体按照选择指数公式计算。选择指数高的菌株即为优良杂交菌株。

1.2.5 优良杂交菌株的初步鉴定

以杂交亲本做对照，综合分析上述农艺性状的多个指标，筛选出几株优良的杂交菌株，通过拮抗试验进行初步鉴定。

1.3 数据处理

采用Excel 2013 和SPSS 20（LSD、Duncan）进行统计分析（P<0.05）。

2 结果与分析

经单孢分离获得113 株单核菌株，从中筛选出30 株优良菌株进行单双杂交，获得27 株杂交菌株，对其菌丝生长情况及农艺性状测定，其中24 株在试验期内产生子实体，具体结果如下：

2.1 不同菌株菌丝生长速率及菌丝生长指数分析

不同菌株的菌丝生长速率差异显著（表1）。菌株D33FP 的菌丝生长速率最小为1.48 mm·d-1；D189FP 和D104FP 的菌丝生长速率最大为2.92 mm·d-1，为 菌 株D33FP 的1.97 倍。27 株杂交菌株中，仅D189FP 和D104FP 的菌丝生长速率大于双亲，13 株菌丝生长速率处于2 个亲本之间，12 株菌丝生长速率小于2 个亲本。

不同菌株的菌落长势评分差异较大（表1）。不同菌株的菌落长势评分由3.00 到5.00 不等，即所有杂交菌株的长势处于中等以上，没有劣等和较差的菌株。其中，仅5 株杂交菌株（D189FP、D165FP、D170FP、D83FP、D178FP）和亲本9608的长势评分达到5 分，长势优良；有8 株（D79FP、D51FP、 D107FP、 D85FP、 D59FP、 D101FP、D149FP、D33FP）长势评分为3 分，长势中等。27株杂交菌株中，有19 株长势评分小于亲本，8 株处于2 个亲本之间。

不同菌株的菌丝生长指数差异显著（表1）。D33FP 的生长指数最小为4.45；D189FP 的生长指数 最 大 为14.62，是D33FP 的3.29 倍。27 株 杂 交菌株中，仅1 株（D189FP）生长指数大于2 个亲本；有10 株（D104FP、D99FP、D175FP、D175FP、D165FP、 D21FP、 D170FP、 D83FP、 D78FP、D97FP、D178FP）生长指数处于2 个亲本之间；其余16 株生长指数小于2 个亲本。

表1 不同菌株菌丝生长速率及菌丝生长指数Table 1 Mycelial growth rates and growth indexes of differ⁃ent strains

2.2 不同菌株子实体形成时间及温度分析

不同菌株子实体形成时间及温度差异较大（表2）。

表2 不同菌株子实体形成时间及温度Table 2 Fruit development time and temperature of different strains

19 株杂交菌株的子实体形成时间小于2 个亲本，其中8 株（D170FP、D175FP、D21FP、D76FP、D78FP、D81FP、D83FP、D97FP）于60 d 内形成子实 体；另 外5 株（D111FP、D149FP、D176FP、D33FP、D85FP）子实体形成时间大于149 d。

19 株杂交菌株的子实体形成温度均高于2 个亲本，其中3 株（D59FP、D99FP、D178FP）子实体形成时的最高温度低于2 个亲本；其中9 株（D83FP、D81FP、D78FP、D184FP、D175FP、D107FP、D104FP、D170FP、D100FP）子实体形成时的昼夜温差大于2 个亲本。

2.3 不同菌株产量分析

不同菌株的成菇数量差异较大（表3）。24 株杂交菌株中，有11 株成菇数量大于2 个亲本，有11株成菇数量小于亲本9608，大于亲本FP，有2 株成菇数量小于2 个亲本。D81FP 的成菇数量最少，平均每袋出菇1.64 朵；D189FP 的成菇数量最多，平均每袋出菇18.50 朵。

不同菌株的子实体产量差异较大（表3）。有16 株杂交菌株的产量大于2 个亲本，其中有11 株的产量大于200 g·袋-1，D97FP 的产量最大，高达350.72 g·袋-1，生物学效率达到70.14%；有3 株（D104FP 和D81FP）产量处于2 个亲本之间；有5株（D107FP、D149FP、D176FP、D85FP 和D86FP）产量小于2 个亲本菌株，其中D85FP 的袋产量最小，仅44.96 g·袋-1。

不同菌株的单菇质量差异较大（表3）。有17株杂交菌株的单菇质量超过亲本9608，其中，D104FP 的 单 菇 质 量 最 大，为55.79 g；6 株（D111FP、D176FP、D189FP、D21FP、D33FP 和D85FP）单菇质量小于2 个亲本，其中D85FP 的单菇质量最小为17.89 g。

表3 不同菌株产量测定结果Table 3 Yield of different strains

2.4 不同菌株子实体形态差异分析

23 株杂交菌株中，仅18 株采收到较多形态正常 的 子 实 体，D85FP、D86FP、D78FP、D176FP、D149FP 和亲本FP 的子实体形态不正常，此处不予以分析。

不同菌株的菌盖厚度差异显著（表4）。18 株杂交菌株的菌盖厚度均小于亲本菌株9608，有9 株菌盖厚度大于2.00 mm，其中D111FP 的菌盖厚度最大为23.86 mm，D170FP 的次之为23.46 mm；余下9 株的菌盖厚度处于1.50～2.00 mm 之间，其中D189FP 的最小为15.55 mm。

不同菌株的菌盖直径差异显著（表4）。18 株杂交菌株中，有7 株菌盖厚直径大于亲本9608，其中的D170FP 菌盖直径最大为76.77 mm；余下11株菌盖直径小于亲本9608，其中的D76FP 菌盖直径最小为55.28 mm。

不同菌株菌柄长度差异显著（表4）。18 株杂交菌株中，7 株菌柄长度大于亲本9608，其中的D107FP 菌柄最长为60.25 mm；11 株菌柄长度小于亲本9608，其中D21FP 的菌柄最短为34.59 mm。

不同菌株的菌柄直径差异显著（表4）。18 株杂交菌株中，有13 株菌柄直径大于亲本9608，其中的D104FP 菌柄直径最大为27.20 mm；余下5 株菌柄直径小于亲本，其中的D178FP 菌柄直径最小为12.77 mm。

不同菌株的菇形指数差异显著（表4）。18 株菌株中，有10 株菇形指数大于亲本菌株，其中的D21FP 菇形指数最大为1.87 mm，显著大于亲本9608；余下8 株菇形指数小于亲本9608，其中的D107FP 菇形指数最小为1.28。

表4 不同菌株子实体形态Table 4 Fruit morphology of different strains

2.5 不同菌株的菌盖硬度差异分析

不同菌株的菌盖硬度差异显著（表5）。18 株杂交菌株中，有17 株菌盖硬度大于亲本，其中的D100FP 菌盖硬度最大为5.30×105Pa；仅D111FP的菌盖硬度显著小于亲本，为3.31×105Pa。

表5 不同菌株的菌盖硬度Table 5 Pileus hardness of different strains

2.6 优良菌株筛选结果

依据选择指数公式得不同菌株的选择指数（表6）。D97FP 和D100FP 的选择指数最大，分别为84.42 和83.07，确定为优良菌株，其子实体形成时间分别为58 d 和63 d，产量分别为339.25 g·袋-1和204.93 g·袋-1，单 菇 质 量 分 别 为22.03 g 和40.99 g，菇形指数分别为1.80 和1.63，硬度分别为4.69×105Pa 和5.30×105Pa。

表6 不同菌株的选择指数Table 6 Selected indexes of different strains

2.7 优良杂交菌株的初步鉴定结果

这两株杂交菌株D100FP 和D97FP 的子实体，菌盖较厚，菌柄较短且细，亲本9608 的菌柄粗长的性状得以改进（图1）。

图1 D100FP（A）和D97FP（B）的子实体形态Fig.1 Fruit morphology of D100FP（A）and D97FP（B）strains

D100FP 与亲本FP 和亲本9608 均有沟壑型拮抗现象，D97FP 与亲本FP 有沟壑型拮抗现象，与亲本9608 有隆起型拮抗现象（图2）。初步鉴定这两个菌株为优良杂交菌株。

3 讨论与结论

不同的单核菌株携带的遗传物质存在差异，其与同一双核菌株杂交获得的杂交菌株遗传物质也存在较大差异，杂交菌株之间存在性状差异［13～15］。本试验中，不同杂交菌株，菌丝生长状况，子实体形成时间及温度，子实体形态，菌盖硬度，产量及子实体数量差异较大，部分菌株与亲本差异显著。从试验结果看出，优于2 亲本的杂交菌株占59.75%，中等的占11.11% ，可见，单双杂交是获得优良菌株的有效途径。虽然拮抗试验结果证实了筛选出的优良菌株D97FP 和D100FP 与其亲本有差异，但仍需通过分子手段进一步检测其遗传物质的差异性，并进行其特异性、稳定性和一致性鉴定，以期获得优良香菇新品种。

消费者购买香菇时主要根据形状、大小、颜色等外形特征进行选择，但口感优劣无法确定。由经验可知，菌盖硬度大的香菇，质地紧密，口感更好，例如，花菇的硬度明显高于普通香菇，其在口感、味道等多方面都优于普通香菇。硬度是评价果蔬品质及成熟度的一个重要指标［16，17］，其检测方法方便快捷，可以大致判断产品的口感，因此，将菌盖硬度作为评价香菇品质的一个指标，符合市场需求及消费者需求。

本试验中，不同菌株的菌盖硬度存在一定的差异，同一菌株在不同环境下形成的香菇，其菌盖硬度也存在差异，一般温度越低、湿度越小，产生的菌盖硬度越大。这一结果跟实际生产中“冬季香菇比夏季香菇品质好”的结论是一致的。

本研究采用多指标综合选择方法筛选杂交菌株，依据香菇的市场变化及我们多年的研究经验对每个指标赋予了相应的权重，建立了选择指数计算公式。该计算公式涵盖了菌丝生长速率、出菇时间、单菇质量、菇形指数、生物学效率及硬度等多项指标，其中菌丝生长速率与出菇时间是生产周期的重要决定性指标，单菇质量、菇形指数与硬度和香菇的商品性相关，生物学效率则与产量相关。选择指数计算公式涵盖了菌棒生产到成菇采收全程的各项重要指标，有一定的合理性，也存在一定的主观性。因此，筛选出的优良菌株有待于市场的认可和实践的检验，其研究方法也有待于进一步完善。综上所述，本研究采用的育种方法是有效的，筛选优良菌株的手段具有一定的合理性，筛选出的优良菌株D100FP 和D97FP 具备出菇早、产量高、硬度大等诸多优点，为香菇生产及新品种选育提供了较好的材料。

图2 拮抗试验结果Fig.2 Antagonistic actions between two strains and their parents