响应曲面法优化金花葵中总黄酮超声提取工艺研究

王苡瑄，殷 萌，韩颖妍，张小飞

(陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046)

金花葵(Aureahelianthus) 为草本锦葵科植物，被广泛用于食品、保健品、观赏等方面[1]。金花葵在《本草纲目》中记载其具有消炎镇痛功效。现代药理学研究证明，金花葵花中所含有的总黄酮具有诸如镇痛、治疗心脑血管疾病和抗炎等多种功效[2]。目前，金花葵总黄酮提取工艺有四种，分别为有机回流法[3]、微波提取法、超声波提取法以及酶解法[4]。前期有多篇文献报道花类药材采用超声波提取具有提取率高、环保无污染、提取效率快等优点，所以旨在单因素提取总黄酮的基础上采用超声提取方法[5]，对提取工艺作进一步优化。

1 实验材料、试剂与仪器

1.1 实验材料与试剂

金花葵(河南省延津县产，批号20180921)；芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司生产，纯度>96%，批号20180719)；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 实验仪器

UV-2600紫外分光光度计(北京京科瑞达科技有限公司生产)；AR1140分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司生产)；KQ-400KDE型高功率数控超声清洗机(上海比朗仪器制造有限公司生产)；SHB-Ⅲ循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司生产)；DHG电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司生产)；RE5298A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂生产)。

2 实验方法

2.1 标准对照液

精密称取芦丁标准品25 mg并将其加入到 100 mL容量瓶中，加入一定量的乙醇超声溶解后定容，配置成标准对照液 (0.25 mg·mL-1)。

2.2 标准曲线的绘制

采用刘琦等人的方法绘制标准曲线[3]。测定不同浓度芦丁溶液的吸光度绘制标准曲线。最终得标准曲线方程：Y=4.790 9X+0.038 9，R2=0.995 2。

2.3 样品测定

金花葵总黄酮粗品制备：将粉碎后金花葵花10 g加入250 mL70%的乙醇超声溶解，抽滤旋蒸即得，按2.2项方法测定其吸光度。

式中，C为金花葵总黄酮浓度(mg/mL)；V为样品的体积(mL)；N为其总的稀释倍数；M为加入的金花葵重量(g)。

2.4 单因素实验

取金花葵粉末10 g于烧杯中，加乙醇溶解，倒入恒温超声提取机，超声一定时间，抽滤、旋蒸，得金花葵总黄酮粗品。考察超声功率、加入的乙醇浓度、物料比三个因素对其总黄酮含量的影响。

2.5 响应面实验设计

分别以超声功率(A)、加入的乙醇浓度(B)及金花葵总黄酮与乙醇溶液的物料比(C)作为考察因素，以金花葵花中总黄酮的含量为响应面值。实验设计、响应曲面法因素编码见表1。

表1 实验因素水平及编码Tab.1 Experimental factors level and coding

3 实验结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 超声功率对总黄酮含量的影响

乙醇浓度选为70%、物料比为25∶1、提取温度为10℃，超声40 min，考察超声功率对金花葵花中总黄酮含量的影响，结果如图1所示。

图1 不同超声功率对超声提取的影响Fig.1 Influence of supersonic extraction of different ultrasonic power

由图1可得，在200～700 W内总黄酮含量随着功率增大而增大，而在700～800 W时随着功率的增大金花葵花中总黄酮提取率逐渐减小。超声功率达到700 W时，金花葵花中总黄酮提取率达到最大值，其随着功率的升高，金花葵黄酮类物质被提取与分离得越多，可功率继续增大到一定程度则会产生杂质而影响总黄酮的提取，所以确定最佳超声功率为700 W。在响应面试验中选择超声功率为600 W、700 W、800 W三个水平进行了响应面实验。

3.1.2 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

超声功率700 W、物料比为25∶1、提取温度为10℃，超声40 min，考察乙醇浓度对金花葵花中总黄酮含量的影响，结果如图2所示。

图2 不同乙醇浓度对超声提取的影响Fig.2 Influence of different ethanol concentration on supersonic extraction

由图2可知，金花葵花中总黄酮提取的最佳乙醇浓度为70%。

3.1.3 物料比对总黄酮含量的影响

超声功率700 W、乙醇浓度70%、提取温度为10℃，超声40 min，考察物料比对金花葵花中总黄酮含量的影响，结果如图3所示。

图3 不同物料比对超声提取的影响Fig.3 Influence of different materials ratio on ultrasonic extraction

由图3可知，物料比15∶1～25∶1时，金花葵总黄酮物质含量随物料比的增加而增加，当物料比大于25∶1时，总黄酮物质含量反而下降，这可能是因为黄酮与乙醇相似相溶，随着乙醇添加量的增加两者发生协同效应，有利于黄酮类物质溶出。当物料比为25∶1时，金花葵中的黄酮类物质几乎全部溶出达到饱和，此后继续增加乙醇添加量，可能使其他物质溶出，影响产品的纯度。所以，在响应面试验中选择物料比为15∶1、25∶1、35∶1三个水平进行响应面优化的条件下，确定最终的最佳物料比为25∶1。

3.1.4 时间对总黄酮含量的影响

超声功率700 W、物料比为25∶1、提取温度为10℃，乙醇浓度为70%，考察超声时间对金花葵药材花中总黄酮含量的影响，结果如图4所示。

图4 不同时间对超声提取的影响Fig.4 Influence of different time on ultrasonic extraction

由图4可知，在提取时间20～40 min，金花葵花中总黄酮提取率逐渐增加，大于40 min后总黄酮提取率逐渐下降，这可能是因为提取时间过短，提取不彻底，金花葵中黄酮类物质无法完全析出导致含量低。随着时间的延长，在剪切力作用下使得金花葵粉末更加细腻，增加了其溶出速度。但当超声时间超过40 min后，可能其他杂质成分溶出增加，导致其含量下降。所以，确定最终最佳的提取时间为40 min。

3.2 响应面实验结果及回归分析

3.2.1 响应面实验分析

结果见表2。

3.2.2 回归模型的建立及其分析

运用Design-Expert 8.0.6.1软件，对表2进行拟合后，得到自变量超声功率(A)、乙醇浓度(B)、物料比(C)与因变量总黄酮物质含量(Y)的二次多项回归方程为：

表2 超声提取响应面实验方案及结果Tab.2 Experiment and results of ultrasonic extraction response surface

Y=280.66+1.88A+9.08B+1.77C+2.71AB+0.21AC+4.80BC-11.83A2-37.51B2-17.47C2，检验结果见表3。

模型方差分析见表3，其中模型的均方差P=0.001 7<0.05，表明该模型显著；失拟项P值为0.633 8，无失拟项。结果显示，影响显著(P<0.05)的因素有：B-浓度、A2 、B2 、C2，各因素的P值反映各因素对响应值的影响，P值越小，表明影响越大。

表3 响应面实验方差分析及显著性检验Tab.3 Analysis of variance and significance testing of response surface experiment

3.2.3 响应曲面分析与优化

响应曲面图是在因变量为总黄酮物质含量的条件下各试验因素交互作用后得到的结果[6-7]。由图5～7可知，3个单因素影响顺序为：乙醇浓度>超声功率>物料比。

图5 物料比与超声功率交互作用Fig.5 Interactive function of materials ratio and ultrasonic power

图6 物料比与乙醇浓度交互作用Fig.6 Interactive function of materials ratio and ethanol concentration

图7 乙醇浓度与超声功率交互作用Fig.7 Interactive function of ethanol concentration and ultrasonic power

3.2.4 最佳提取工艺确定及验证试验

经Design-Expert 8.0.6.1软件计算分析，最佳工艺条件为：超声功率为709.49 W、乙醇浓度为71.29%、物料比25.70∶1,在此条件下模型预测总黄酮物质含量为281.392 mg/g。采用3次工艺验证其总黄酮含量为281.403 6 mg/g，验证结果较好，说明所拟合的模型方程可以较好地反映金花葵总黄酮的提取过程。

4 结论

本实验进行响应面优化筛选后,三个考察因素对金花葵中总黄酮物质含量影响的大小顺序为∶ 提取温度<功率<浓度。最佳工艺为超声功率为709.49 W、乙醇浓度为71.29%、物料比为25.70∶1，3次平行验证试验的平均总黄酮物质含量为281.403 6 mg/g，该实验为金花葵的提取及后续开发提供实验基础。