酸性土壤条件下纳米氧化锌长期暴露对蕹菜生长和叶绿素荧光参数的影响

傅一挺，吉莉，陈延松

(合肥师范学院生命科学学院，安徽 合肥 230601)

20世纪80年代以来，纳米材料因其独特的物理、化学、生物性能，被广泛应用于光电、能源、医药、生物等领域中。近年来，随着纳米科技的迅速发展，它一方面促进了世界经济发展并对人类生活产生了重要影响；但另一方面，纳米材料尤其是金属纳米材料[1-2]对动物、植物、微生物乃至人类的毒性也越来越多地被人们关注。

金属纳米材料在其生产、运输、使用过程中易被释放到大气、土壤或水环境中，进而对生命有机体产生影响[3]。实践研究表明，金属纳米材料对植物的生态毒性已成为一个倍受关注的全新领域。然而，不同金属纳米材料对不同植物产生毒性的机理不同，这主要取决于它们本身的理化性质、受试植物和环境介质[4-6]。

纳米氧化锌(nano-ZnO)具有优良的吸收紫外线、抗菌消毒等特点，是一种应用范围很广的金属纳米材料。研究表明，nano-ZnO对细菌[7]、藻类[8]、动物[8]、植物[9]等均具有急性或慢性生态毒性。nano-ZnO对植物的毒性一方面来自纳米颗粒本身，另一方面则来自释放出的锌离子，尤其是在酸性条件下，超过60%的nano-ZnO会释放出锌离子至溶液中[5]。植物体中浓度过高的锌离子会对植物的生理生态特性及其生长产生影响[10]。然而，目前有关nano-ZnO的植物毒性研究主要是基于水培条件下完成的[5,9,11-12]，更缺乏酸性条件下植物对长期暴露的胁迫响应。现以蕹菜(IpomoeaaquaticaForsk.)为受试植物，通过土培盆栽实验，探究弱酸性条件下nano-ZnO长期胁迫对蕹菜的生理生态效应。研究结果将拓宽对nano-ZnO与植物相互关系的认识，也可为nano-ZnO的生态风险评估提供参考。

1 实验部分

1.1 实验材料

蕹菜种子300 g/袋(北京大禾龙腾国际种子有限公司，约10 000粒)；nano-ZnO[上海阿拉丁工业公司,纯度为99.9%，颗粒粒径为(30±10)nm]；栽培盆(盆口直径16.0 cm，盆底直径12.5 cm，盆高17.0 cm)。

弱酸性土壤配制：将购自市场的酸性营养土与林下0～15 cm表层土按体积比1∶1充分混匀，自然晾干后待用。经检测，主要物质质量比为有机质58.16 g/kg，总氮3.26 g/kg，总磷2.20 g/kg，总钾13.12 g/kg，pH值=6.05。

1.2 样品处理

1.2.1 土壤处理

将干燥后的混合土壤去除杂质，均分为8组，每组分别按锌质量比0，5，10，20，40，80，160 mg/kg施加nano-ZnO，充分搅拌10～15 min，混匀后等份装盆，每组操作重复5次。

1.2.2 种子萌发与幼苗栽培处理

选取饱满且大小均匀的健康蕹菜种子200粒，用50～60 ℃的温水浸种30 min后，于清水中浸种20 h，取出洗净，置于室温下湿润的纱布上催芽。待种子胚根突破种皮，随机取其中140粒，种入上述经过nano-ZnO处理的土壤中。每盆均匀播种4粒种子，播种完后用封口膜包裹密封栽培盆盆口，再置于人工气候室中培养。幼苗建成后，每天浇水以保持土壤湿润。人工气候室条件设定为光照12 h，温度30 ℃，光照强度为200 μmol/(m2·s)；黑暗12 h，温度25 ℃，相对湿度(55±5)%。

整个培养实验时间为2017年11月19日—2018年1月26日。在培养阶段的最后一周内进行叶绿素相对含量、形态学指标、生物量以及叶绿素荧光诱导动力学参数等实验指标测量。各项指标均以每盆4株植物的平均值为一个重复观测值，n=5。

1.3 测定方法

形态学指标的测定：使用直尺测定株高，计数法记录叶片数目。

叶绿素相对含量(SPAD)的测定：采用SPAD-502 Plus(Minolta Japan,Konica)叶绿素计测量。以植物形态学上端第一片完全展开的叶片为测量单元测量时，选择叶片中间位置为测量点并避开明显的叶脉，取3次读数平均值。

生物量的测定：待上述实验结束，小心地将所有植株挖出并做好标记，先用自来水清洗掉根部土壤，再用双蒸水清洗3次，分成冠部和根部，置于65 ℃烘箱中烘干48 h至恒重，使用万分之一电子天平测量冠部干重和根部干重并计算总干重和根冠比。

叶绿素荧光参数的测定：采用Junior-PAM(Walz,Germany)基础型调制荧光仪测定。首先，将测量对象置于暗环境中适应30 min后，测定最大量子产量(Fv/Fm)。然后使用人工光源自动测量15次，光照强度为190 μmol/(m2·s)下的叶绿素荧光诱导动力学参数，主要包括电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数(qL)、非光化学淬灭系数(NPQ)、光系统II(Phtosynthetic system II, PSII)实际量子产量(ΦPSII)、光诱导的非光化学淬灭(ΦNPQ)和非光诱导的非光化学淬灭(ΦNO)。取最后3次读数的平均值。

1.4 数据分析

所有数据均以(平均数±标准误差)表示。基于IBM SPSS statistics 23.0 软件包 (IBM, Chicago, USA)，使用单因素方差分析及Duncan多重比较检测不同处理间叶绿素相对含量、生长参数和叶绿素荧光诱导动力学参数的差异性，显著性水平为0.05。使用Origin 8.5进行作图(Origin Lab, USA)。

2 结果与讨论

2.1 nano-ZnO胁迫对蕹菜叶绿素相对含量(SPAD)的影响

图1为土壤中nano-ZnO对蕹菜SPAD的影响，其中，n=5，柱顶部小写字母不同表示有显著差异，α= 0.05，下同。由图1可见，土壤中nano-ZnO质量比在0 ～20 mg/kg范围内，蕹菜SPAD基本相同，随着土壤中nano-ZnO质量比继续升高(>20 mg/kg)，SPAD则迅速持续下降。当土壤中nano-ZnO质量比达到160 mg/kg时，蕹菜SPAD仅为17.977，相较于对照组显著减少了55.63%(F=18.619,p=0.000)。

图1 土壤中nano-ZnO对蕹菜SPAD的影响

2.2 nano-ZnO胁迫对蕹菜生长参数的影响

2.2.1 对生物量和根冠比的影响

图2(a)(b)(c)(d)为土壤中nano-ZnO对蕹菜生物量、根冠比、叶片数量和植株高度的影响，由图2(a)可见，随着土壤中nano-ZnO质量比的增加，蕹菜的冠部生物量、根部生物量、总生物量均呈先增大后减小的趋势。当nano-ZnO质量比为20 mg/kg时，冠部生物量、根部生物量、总生物量均达到最大值，分别为0.299，0.149，0.447 g，较对照组分别增加了30.10%，28.57%，42.36%，但未达到显著性水平。随着nano-ZnO质量比进一步升高，3个指标值均逐渐减小。当nano-ZnO质量比为160 mg/kg时，冠部生物量(F=2.454,p=0.049)、根部生物量(F=2.780,p=0.030)、总生物量(F=2.600,p=0.039)分别减少至0.165,0.064,0.229 g，与对照组相比减少了21.05%,39.05%,27.07%，也未达到显著水平，但与最高值组相比则差异显著。由图2(b)可见，不同nano-ZnO胁迫处理之间根冠比无显著差异(F=0.689,p=0.660)。

2.2.2 对叶片数量和植株高度的影响

从图2(c)和(d)可以看出，随着nano-ZnO质量比的增加，蕹菜叶片数量和植株高度也均表现为先增加后减小的趋势。但是只有叶片数量的增加达到了显著水平(F=3.136,p=0.018)，而植株高度的增加并未达到显著水平(F=2.137,p=0.080)。当nano-ZnO质量比为160 mg/kg时，叶片数量和植株高度均降至最低值，分别为12.200枚和10.220 cm，均显著低于最高值组；但与对照组相比，分别降低了6.01%和10.82%，并未达到显著性水平。

图2 土壤中nano-ZnO对蕹菜生物量、根冠比、叶片数量和植株高度的影响

2.3 nano-ZnO胁迫对蕹菜叶绿素荧光诱导动力学参数的影响

图3(a)(b)(c)(d)为土壤中nano-ZnO对蕹菜Fv/Fm、ETR、qL和NPQ的影响，由图3可见，Fv/Fm与ETR变化趋势基本一致。当土壤中nano-ZnO质量比为0～80 mg/kg时，不同处理间Fv/Fm与ETR有极小幅度的先增后减变化且未达到显著性水平；与对照组相比，当质量比达到160 mg/kg时，Fv/Fm(F=3.325,p=0.013)与ETR(F=4.001,p=0.005)则显著降低至0.716和30.723，分别下降了8.32%和23.63%，见图3(a)(b)。当土壤中nano-ZnO质量比介于0～80 mg/kg时，不同处理间的qL无显著变化(p>0.05)，NPQ差异也不显著(p>0.05)；与对照组相比，当质量比达到160 mg/kg时，qL(F= 3.732，p=0.034)和NPQ(F=4.281，p=0.015)则分别增加了28.37%和90.56%。

图3 土壤中nano-ZnO对蕹菜Fv/Fm、ETR、qL、NPQ的影响

图4(a)(b)(c)为土壤中nano-ZnO对蕹菜ΦPSII、ΦNO和ΦNPQ的影响，由图4可见，当土壤中nano-ZnO质量比介于0～80 mg/kg时，不同处理间的ΦPSII和ΦNPQ无显著差异。与对照组相比，当土壤中nano-ZnO质量比达到160 mg/kg时，ΦPSII显著降低至0.385(F=4.005,p=0.005)，下降了23.38%，见图4(a)；相反的是ΦNPQ显著升高至0.260(F=2.680,p=0.035)，上升了41.54%，见图4(c)。不同处理间非光诱导的非光化学淬灭(ΦNO)无显著差异(F=0.945,p=0.479),见图4(b)。

图4 土壤中nano-ZnO对蕹菜ΦPSII、ΦNO、ΦNPQ的影响

2.4 nano-ZnO质量比与蕹菜叶绿素相对含量、生长参数、叶绿素荧光参数的关系

表1为土壤中nano-ZnO质量比与蕹菜生长参数、叶绿素荧光参数的相关性，由表1可见，土壤中nano-ZnO质量比与蕹菜叶片叶绿素相对含量具有极显著负相关关系，且相关程度高(r=-0.879,p=0.000)；与总生物量、叶片数等生长参数也具有极显著负相关关系，但相关程度不高；与Fv/Fm、ETR、ΦPSII呈极显著负相关关系，与NPQ、ΦNPQ呈极显著正相关关系，与qL呈显著正相关关系，但相关程度均不高。

表1 土壤中nano-ZnO质量比与蕹菜生长参数、叶绿素荧光参数的相关性(n=35)

2.5 nano-ZnO胁迫对蕹菜叶绿素相对含量和生物量累积的影响

Mg2+是高等植物叶片中合成叶绿素大分子的一个重要元素。叶片中低浓度Zn2+并不会影响植物生长，反而对植物生长具有一定促进作用[13-14]。然而，当叶片中Zn2+浓度过高时，它便会取代Mg2+，破坏叶绿素大分子，最终扰乱植物正常的光合作用和生物量累积[10]。不同植物对nano-ZnO的生态响应不同。例如，在水培条件下，对于甜菊(SteviarebaudianaBertoni)而言，≤1 mg/L的nano-ZnO质量浓度可对其生长产生促进作用，当nano-ZnO质量浓度>10 mg/L时则会抑制甜菊生长[9]；对于水稻(OryzasativaL.)而言，当nano-ZnO质量浓度>50 mg/L时，才会显著抑制水稻叶片叶绿素合成，抑制其生长[15]。本研究显示，土壤中nano-ZnO质量比与蕹菜叶片叶绿素相对含量呈极显著负相关关系，且相关程度高(r=-0.879,p=0.000)。然而，当其质量比<40 mg/kg时，蕹菜叶片叶绿素相对含量首先呈现出缓慢增加趋势，与之相对应的是蕹菜根部生物量、冠部生物量、总生物量、植株叶片数量、植株高度也均表现出缓慢增加趋势，即土壤中低质量比氧化锌可促进蕹菜生长；当其质量比>40 mg/kg时，蕹菜叶片叶绿素相对含量显著下降，并最终导致蕹菜根部生物量、冠部生物量、总生物量、叶片数量、植株高度均表现出下降趋势，即土壤中高浓度氧化锌对蕹菜生长具有抑制作用，这个现象和nano-ZnO在酸性条件下极易释放出Zn2+有关[5,16]。另外，土壤中nano-ZnO胁迫并未对蕹菜根冠比产生显著影响。

2.6 nano-ZnO胁迫对蕹菜叶片光合能力的影响

Fv/Fm反映了PSⅡ反应中心内禀光能转换效率和植物的潜在光合活性[17]。对于绝大多数高等植物而言，非胁迫条件下它们的Fv/Fm波动幅度极小，即使在轻度胁迫逆境中，该参数的变化也不大，而只有在中度及以上胁迫条件下该参数才会明显下降[18]。在0～80 mg/kg范围内，蕹菜叶片Fv/Fm对nano-ZnO的响应是一个很缓慢且幅度很小的先升后降的过程，只有当nano-ZnO质量比达到160 mg/kg时，Fv/Fm才显著下降，这也和ETR显著降低的结果相一致。

qL表示植物将分配给PSII反应中心的能量用于光合电子传递能力，间接反映植物对光能的转化能力。NPQ表示植物将将分配给PSII反应中心但不能用于光合电子传递的过剩能量以热能形式耗散的能力，是一种植物对光合机构的自我保护机制。ΦNPQ和ΦNO主要用于衡量非光化学猝灭途径的能量分配特性。ΦPSII表示PSII反应中心部分关闭时的实际原初光能捕获效率。在不同光照条件下，ΦNPQ、ΦNO、ΦPSII三者间存在一个动态平衡状态，即ΦNPQ+ΦNO+ΦPSII= 1。

研究表明，土壤中nano-ZnO质量比为0～160 mg/kg时，蕹菜叶片qL对其响应无明显规律。当土壤中nano-ZnO质量比达到160 mg/kg时，蕹菜叶片NPQ、ΦNPQ均显著升高，但ΦNO无显著变化。说明该处理条件下，蕹菜植物体内PSII反应中心失活数量显著升高，植物体内的激发能量已过剩，但过剩的能量尚可通过热能耗散进行调节，以使反应中心免受光伤害。

3 结论

弱酸性土壤环境条件下，低质量比nano-ZnO (≤ 20 mg/kg) 长期暴露对蕹菜生长具有促进作用，高质量比nano-ZnO (≥ 40 mg/kg)则具有抑制作用，但对其生物量分配均无显著影响。低质量比nano-ZnO (≤ 80 mg/kg) 长期暴露对蕹菜叶片光合能力无显著影响，高质量比nano-ZnO (160 mg/kg)长期暴露会导致蕹菜叶片光合能力显著下降。检测蕹菜受nano-ZnO长期暴露影响程度时，叶绿素相对含量和生物量指标优于弱光诱导的叶绿素荧光参数指标。