中药注射剂类过敏反应研究进展

文雯　梁慧慧　余格　赵 靖　李原华　刘文龙　刘红宇

〔摘要〕 中药注射剂（traditional chinese medicine injections，TCMIs）临床疗效确切，但其类过敏反应频发，日益增多的不良反应事件已成为当前中药安全性研究的热点和难点。类过敏反应的发生机制尚未完全明确，其常规评价标准及风险防控措施还存在一定局限性，亟需建立一套能广泛筛查TCMIs类致敏原、明确类致敏发生机制的TCMIs安全性评价方法。本文对近年来有关TCMIs类过敏反应的机制、物质基础以及评价方法的研究进行综述，旨在深入挖掘TCMIs类过敏反应的综合信息，以期为建立TCMIs类过敏反应评价与风险防控新方法、减少TCMIs临床不良反应的发生提供新的思路。

〔关键词〕 中药注射剂;类过敏反应;不良反应;物质基础;细胞模型;动物模型

〔中图分类号〕R28       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.026

〔Abstract〕 Traditional Chinese medicine injections （TCMIs） have definite clinical efficacy， while their anaphylactoid reactions are frequent， and the increasing number of adverse reaction events has become a hot and difficult point in the research of Chinese materia medica safety. The mechanism is not completely clear， and there are still some limitations in conventional evaluation criteria and risk control measures. It is urgent to establish the safety evaluation methods for TCMIs， which can widely screen the allergens and clarify the mechanism of anaphylactoid reactions. In this paper， the research on the mechanism， material basis and evaluation methods of TCMIs anaphylactoid reactions in recent years were reviewed. The purpose is to dig out the comprehensive information related to the reactions， in order to provide the ideas for establishing a new risk control method for anaphylactoid reaction evaluation， so as to reduce the occurrence of clinical adverse reactions of TCMIs.

〔Keywords〕 traditional Chinese medicine injections; anaphylactoid reactions; adverse reactions; material base; cell model; animal model

中药注射剂（traditional chinese medicine injections，TCMIs）是由中医药理论指导，采用现代科学技术与方法，从中药、天然药物的单方或复方中提取有效物质制成的可供注入体内（包括肌内、穴位、皮内、皮下、静脉以及其他组织或器官）的灭菌制剂以及供临床前配制溶液的无菌粉末或浓缩液[1]。TCMIs療效确切、生物利用度高、起效快，解决了中医临床没有急症用药的痼疾[2-3]。近年来，TCMIs的发展道路颇为坎坷，原因是随着临床的广泛应用以及不良反应监测力度增强，有关TCMIs的不良反应报道越来越多，在国家药品不良反应监测中心发布的《国家药品不良反应监测年度报告（2017年）》中，TCMIs占中药不良反应/事件报告的54.6%[4]。TCMIs的临床安全饱受争议，给TCMIs行业敲响了警钟。自2006年鱼腥草注射液不良反应事件爆发至今，国家食药总局已宣布限用、禁用多种TCMIs，并要求部分品种修改说明书。

TCMIs的不良反应以（类）过敏反应为主[5]，其中类过敏反应（Anaphylactoid reactions）约占77%，主要表现在皮肤、消化系统、呼吸系统、神经系统、心血管系统等，包括皮肤黏膜红肿、瘙痒、腹痛、恶心、胸闷、呼吸困难以及血压下降等症状，甚至会发生休克和死亡[6]。类过敏反应的发生机制尚未完全明确，其常规评价标准及风险防控措施还存在一定局限性，亟需建立一套能广泛筛查TCMIs的类致敏原、明确类致敏机制的TCMIs类过敏反应评价方法。本文将从TCMIs引发类过敏反应的机制、物质基础和评价方法三个方面对近年的相关研究作出综述，并对研究存在的不足展开讨论，以期为进一步研究和风险防控新方法的建立提供思路和参考。

1 类过敏反应发生的机制

TCMIs类过敏反应的发生机制可能与肥大细胞（mast cell，MC）脱颗粒释放组胺（Histamine， HIS）、补体系统的激活、花生四烯酸代谢等有关，可通过以下几个环节激发。

1.1  直接刺激MC

潘卫松等[7]研究发现，清开灵注射液（Qingkailing injection，QKLI）不含HIS类物质的情况下可引发小鼠类过敏反应，且MC膜稳定剂色甘酸钠（可抑制MC脱颗粒）对其具有干预作用，提示QKLI可直接刺激MC脱颗粒释放内源性HIS从而引发小鼠类过敏反应。

1.2  补体激活

血清补体主要有C1～C9[8]等9种，激活的途径有激活经典途径、激活旁路途径和甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin，MBL）途径，这3条途径最终都是通过形成C3转化酶，释放C3a、C5a过敏毒素等补体活化片段，可与MC表面的C3aR和C5aR结合，使体内外靶细胞脱颗粒，引起机体类过敏反应。樊孟[9]研究发现双黄连注射液（Shuanghuang？鄄lian injection，SHLI）和香丹注射液均可通过补体激活相关机制致小鼠类过敏，此外还有研究表明，脂质体、聚氧乙烯蓖麻油（cremophor EL，erEL）、造影剂RCM和吐温-80等均可激活补体系统途径而致敏[10-11]。

1.3  激活Ca2+通道

TCMIs致敏原可通过激活G蛋白，进而激活蛋白激酶C和Ca2+相关信号通路，胞内Ca2+浓度上升时，RBL-2H3细胞脱颗粒并释放HIS、β-氨基己糖苷酶等生物介质，从而致类过敏发生[12-13]。

1.4  其他通道

张波等[14]在QKLI诱发类过敏反应的研究中发现QKLI可激活RBL-2H3细胞内磷脂酰肌醇3-激酶（ phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、Rac1、PAK1蛋白参与调节细胞骨架重排，PAK1同时可激活LIMK1酶，LIMK1酶再反向激活Cofilin。因此致使RBL-2H3细胞内PI3K活性提高，使Rac1、PAK1、LIMK1和Cofilin蛋白含量呈剂量性增高，提示QKLI的类过敏反应可能是由基于细胞流动性改变，PI3K-Rac1细胞运动信号转导通路引起细胞骨架重排所致。

2 类过敏反应发生的物质基础

引起TCMIs类过敏反应的因素是多方面的，如药物制备工艺不规范，使制剂内大分子物质残留[15]，临床上不按中医证候辨证施治原则施药、配伍不当、超适应症和超剂量给药[16-18]，以及患者的个体差异（年龄、性别）[19-20]等。在TCMIs致类过敏反应的相关物质基础研究中，发现其辅料和原药材成分皆具有类致敏性。

吐温-80常作为增溶性辅料应用于TCMIs。已有研究证明吐温-80和鱼腥草注射液存在的严重不良反应有密切关系[21]。吐温-80导致的类过敏反应，可能与其外源性大分子杂质有关[22]，目前的工艺还无法完全除去这些杂质。TCMIs的成分TCMIs由植物原药材提取加工而成，成分多且复杂，部分成分同时也具有类致敏作用。如SHLI中的绿原酸、隐绿原酸和黄芩苷可使HBL-2H3细胞脱颗粒[23-24];人参皂苷Rd和人参皂苷20（S）-Rg3能显著提高RBL-2H3细胞中HIS、β-己糖胺酶的释放和磷脂酰丝氨酸的转移，增加MPMCs和LAD2细胞的细胞内Ca2+浓度[25-26];静脉注射三七总皂苷制剂可引起小鼠耳廓血管通透性增高，耳廓明显蓝染肥大以及MC脱颗粒现象[27]，均提示以上成分具有潜在的类致敏作用。此外小分子物质5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural，5-HMF）广泛存在于糖类TCMIs中，其浓度较高时还可检测到一定浓度的二聚体双-（5-甲酰基糠基）醚（5，5'-Oxydimethylenebis（2-furfural），OBMF），林琳[28]首次发现二者可引起体外MC发生类过敏反应和Ⅰ型超敏反应，后者的生成会增加前者的免疫毒性。

3 类过敏反应的评价方法

3.1  体外细胞模型

3.1.1  MC模型  类过敏体外实验研究一般都采用原肥大细胞或嗜碱性粒细胞，MC是类过敏反应主要效应细胞，其能通过脱颗粒分泌HIS，各种炎症和免疫调节物质从而引起机体生理及病理的变化[29-30]。这类模型多以靶细胞为研究对象，探求其类过敏介质的释放机制，细胞脱颗粒率、细胞超微结构变化、HIS、β-己糖苷酶为RBL-2H3细胞脱颗粒的重要评价指标[31]。常用的MC如下。

RBL-2H3细胞具有MC的许多生物学特性，具有灵敏、快速、方便的特點，现已广泛用于药物类过敏反应的体外研究。范姗姗等[32]建立了基于实时细胞分析（real-time cell analysis，RTCA）系统的RBL-2H3细胞类过敏反应评价方法，以细胞指数（cells index，CI）、细胞形态、骨架变化和HIS和β-已糖苷酶释放量为考察指标，可敏感的评价RBL-2H3细胞脱颗粒，并已成功用于20个批次的注射用益气复脉（冻干）的类过敏反应评价。Han Shengli等[24]建立了RBL-2H3/CMC在线液质联用系统（LC/MS），通过体外RBL-2H3细胞脱颗粒、己糖胺酶释放实验和LC/MS的成分筛查，成功鉴定出黄芩苷是SHLI中潜在的类致敏原。王化龙等[33]运用RBL-2H3细胞脱颗粒模型与高内涵检测结合的方法，对细胞脱颗粒囊泡和细胞核染色标记，计算出30批次红花注射液的细胞脱颗粒率，验证了红花注射液的类致敏作用，与传统方法检测的结果高度一致，是一种更灵敏、可靠且可实现高通量筛选的新评价手段。韩森等[34-35]建立的RBL-2H3细胞胞内Ca2+浓度及致敏介质检测的方法比传统方法更加方便、快捷，同时还可以避免β-氨基己糖苷酶检测方法中因药物颜色干扰而出现的假阳性结果，具有较高的应用前景。

小鼠肥大细胞瘤细胞P815因具有MC的特殊性质而被发现，逐渐被用于体外过敏反应研究[36]。Peng Bo等[37]发现在相同刺激条件下，compound40/80（C48/80）激活RBL-2H3和P815后，后者细胞过敏介质释放率、Annexin V阳性率和脱颗粒率均高于前者细胞，后者活化后脱颗粒现象出现更早、程度更高。可以看出，P815细胞较RBL-2H3细胞在脱颗粒的研究中灵敏度更高，可作为一种早期TCMIs过敏反应评价模型。

冯宇飞等[38]通过建立大鼠腹腔肥大细胞（rat per-i onealmast cells， RPMC）模型研究SHLI类过敏反应，结果显示RPMC脱颗粒实验指标变化不明显，提示组方中的3种主要有效成分与类过敏反应无直接关系。

3.1.2  人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）  Han等[39]建立了将HUVEC单层与SHLI（0.05、0.1或0.15 mg/mL）一起孵育，以内皮通透性和细胞骨架的变化为观察指标，并结合蛋白质印迹分析的方法，发现SHLI可诱导产生类过敏反应。

3.2  动物模型

类过敏研究主要用到的实验动物有Beagle犬、大鼠、小鼠、豚鼠等[40]，不同品种或品系的动物的类过敏反应易感性和表现不同[41]。

3.2.1  大鼠  大鼠皮肤类过敏试验敏感、可靠，适宜于注射剂临床前类过敏反应评价。目前大鼠的类过敏反应评价指标主要是蓝斑直径、蓝斑直径结合伊文思蓝（evens blue，EB）渗出量，也可以选定皮肤蓝斑OD与对照部位皮肤蓝斑OD比值（K）作为评定标准[42]。梁爱华等[43-44]建立了基于改良Miles Assay法的大鼠皮肤类过敏模型，给大鼠皮内注射不同稀释度的紫杉醇注射液和盐酸胺碘酮注射液，尾静脉注射指示剂EB，皮内蓝斑直径和EB渗出量结果显示2种注射剂均可使皮肤形成较大范围的蓝斑，提示可引起类过敏反应，与临床结果具有很好的一致性。陈桂荣等[45]创新性地将iTRAQ蛋白组学技术研究结合BN大鼠类过敏反应模型，从蛋白质组学角度成功鉴定出7个C48/80诱导类过敏反应的候选生物标志物。

3.2.2  小鼠  建立小鼠类过敏反应模型时，通常采用血管通透性实验，根据耳廓蓝染动物数、耳廓蓝染发生率、腹部黏膜蓝斑和EB渗出量来综合评价类过敏反应强度[9]。张宇实等[46]以耳廓蓝染发生率和EB渗出量作为TCMIs类过敏反应评价指标，比较不同品系、年龄的小鼠的敏感性。结果显示，ICR敏感度最高，昆明小鼠次之，BALB/C和C57小鼠敏感性较低，提示可选用前2种小鼠作为模型动物。此外，雄性小鼠对类过敏实验更为敏感。易艳等[47]建立ICR小鼠类过敏模型结合液质联用成功分离出并确定连翘酯苷A是SHLI的主要类致敏成分之一。练雪萍开展了人参皂苷Rd致小鼠急性类过敏反应研究，结合代谢组学研究成功鉴定出共20个可能与类过敏有关的差异代谢物[48]。

3.2.3  豚鼠  梁爱华等[49]建立了TCMIs类过敏豚鼠模型，该模型证明了吐温-80是主要的类致敏物质，静注含吐温-80的受试药物的豚鼠，会发生耳廓血管通透性增高，且反应呈剂量依赖性，而注射不含吐温-80的受试药物的豚鼠，未发生该反应。

3.2.4  Beagle犬  梁爱华等[50]用Beagle犬进行TCMIs的类致敏试验发现Beagle犬对吐温-80具有高敏感度，其首次注射0.5%吐温-80和含吐温-80鱼腥草注射液后很快出现皮肤局部红肿、瘙痒，精神状态变差，血压降低、呼吸和心率加快等与临床上人的类过敏反应相似的症状，提示Beagle犬可作为临床前评价TCMIs类过敏反应动物模型，该模型灵敏度高、重复性好、与临床具有高度一致性。李汉成等[51]考虑到临床患者的状态，建立了环磷酰胺致免疫低下Beagle犬模型，通过比较免疫低下与正常Beagle犬在静脉注射肿节风注射液后的类过敏反应，发现30 min内免疫低下组HIS含量升高较正常组显著，即免疫低下组类过敏反应强度大于正常对照组，结果提示该模型的建立有效。

4 讨论

4.1  TCMIs主要是通过直接或间接刺激MC脱颗粒而致敏，目前有关机制的研究大多停留在MC脱颗粒及介质释放。然而，TCMIs类致敏机制是多成分多靶点多环节的。在TCMIs进入人体后至刺激MC的过程中，致敏性是源自其组分自身，还是源自其组分进入机体内反应生成的新物质，MC的激发通路是由类致敏性成分直接刺激还是涉及一个或多个通路间接刺激，这些问题值得重度与深度的研究。

4.2  TCMIs引发的类过敏反应涉及到体内外多环节的因素，由于体外的制剂、用药等环节的因素皆为可控因素，而药物类致敏成分的复杂性、不稳定性，以及成分进入机体内部引发类过敏所发生的各种复杂反应才是目前的研究难点，因此应严格规范其制备工艺与临床合理用药，降低其在临床使用中的不良反应发生率，以便更全面研究TCMIs在体内引起类过敏反应的原因。如吐温-80仍在作为辅料用于一部分现存TCMIs，存在极大的安全隐患，可尝试寻找其他安全性高的辅料替代，以降低其类过敏发生风险。

4.3  目前已探索出多种细胞、动物类过敏反应模型，通过这些模型成功确定了多种TCMIs的类致敏原，并推出了相关类致敏通路和机制。然而，我国的《中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光变态反应）研究技术指导原则》[52]中迄今尚未制定关于类过敏试验的指导原则，有关评价方法仍然缺乏，实验中的观察指标缺乏客观性，不利于TCMIs的临床应用与发展。因此，有必要修订和完善类过敏试验的评价标准及指导原则。此外，由于种属差异性和药物性质差异等，体外细胞模型并不能完全预测TCMIs类过敏反应。如药物浓度和细胞毒作用影响RBL-2H3细胞导致检测结果产生偏差;致敏性成分检测结果呈假阴性，非致敏性成分检测结果呈假阳性等。大多数研究是通过单一模型对单成分的单通路类致敏反应检测，对于这些成分多以是否具有致敏性的研究为主，研究结果具有局限性。受练雪萍、刘晓娟等[48，53]的研究的启发，可以推测TCMIs进入生物系统后，起效（毒）的可能是复方中的原形成分或代谢产物，或是与机体作用形成的新成分（可能涉及到機体能量代谢、分子信号传导或免疫炎症反应等方面），三者构成体内中药成分的代谢物组，进而通过多靶点、多系统综合干预人体内源性代谢物组来起作用，致使机体发生类过敏反应。因此，在进行TCMIs的安全性评价时，可以先基于体外MC模型进行早期的TCMIs类致敏性评价，并找出其一级致敏通路，同时建议研究时参考临床剂量，设多个浓度组，再根据TCMIs的有效成分、辅料的性质特点，结合前期的研究资料，选用较为敏感的动物模型，进行体内类致敏试验，深入蛋白质组学、代谢组学等研究，尝试多种方法相联合全面探索出类过敏反应作用机制。本课题组基于此，现已开展基于代谢组学的中药注射剂类致敏成分与机制的研究工作。此外结合临床建立不同免疫状态的动物模型来评价TCMIs类致敏性也值得研究。

5 展望

TCMIs作为中药发展进程的一个重要里程碑，其安全性问题已成为公众关注的焦点，急需基于现有的研究基础，更系统性地筛查类致敏原，推测作用通路，明确类致敏作用机制，以期尽早实现TCMIs类过敏反应风险评价与防控新方法的建立。这将对TCMIs的临床用药安全意义重大。

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（本文编辑  匡静之）