沙门菌Hfq依赖型小RNA GcvB靶基因trpE的鉴定

潘 永，杨 阳，李 晨，刘丽娟，杨 琦,5*

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；3.贵州省畜禽资源遗传管理站，贵州 贵阳 550025；4.都匀市动物疫病预防控制中心，贵州 都匀558000；5.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium，serovartyphimurium LT2，STM LT2)是最常见于人类和动物胃肠道感染中分离的血清型之一，也是研究最多的细菌病原体之一[1]。因其重要且生长要求较低并易培养，长期被视作研究细菌的模型之一。

细菌小RNA(small RNA，sRNA)是普遍存在于细菌中长度约为40～500 nt的非编码RNA分子。目前可把sRNA分为3类[2]，其中最重要一类sRNA具有调控细菌基因转录后表达作用，sRNA能与靶mRNA相互作用并影响mRNA的稳定性进而抑制或促进mRNA翻译[3]。STM LT2中已经报道过的sRNA 以GcvB的研究为主，研究表明，GcvB在与STM LT2大部分靶mRNA作用时依赖伴侣蛋白Hfq调节，该伴侣蛋白通过与GcvB协同作用影响STM LT2毒力、营养物质的摄取、氨基酸合成以及应激反应机制等[4]。因此，更多 GcvB的生物学功能还待研究。

此前，关于GcvB研究主要在大肠杆菌和沙门菌中，以Hfq为切入点，筛选受Hfq及GcvB共同作用的靶基因。到目前为止，在STM LT2中已鉴定的受GcvB及Hfq调控的靶标至少20个[5]，除此之外，自GcvB 3个种子结合区被证实以来，建立种子结合区R1(TTGGCTTACGGTTGTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGCAATTGGTCTGCG)、R2(ACUUCCUGUA)和R3(CUGUC)区的单敲除或多敲除的模型筛选受GcvB调控的靶基因也成为另一种命中率较高的方式[6]。MURPHY等[7]1998年首先尝试用λ噬菌体Red重组系统在大肠杆菌中构建基因缺失,由此建立了新的原核缺失操作技术，之后在辅助性质粒pKD46中表达整套Red同源重组系统,首创两步同源重组法,使原核缺失变得简单高效。本实验室前期转录组研究结果显示STM LT2gcvB或Hfq基因的缺失导致编码邻氨基苯甲酸合酶Ⅰ和参与氨基酸生物合成和代谢的trpE基因转录水平分别上调2.2和2.4倍，但该研究仅在转录水平验证了trpE基因受GcvB和Hfq调控，是否在蛋白表达水平受到影响并未探究。

本研究通过Red同源重组系统构建trpE基因的lac融合，通过P22噬菌体转导技术构建gcvB和Hfq基因单缺失及双缺失株，β半乳糖苷酶试验检测该基因的蛋白表达活性，并结合生物信息学系TargetRNA2分析trpE基因与GcvB R1区的作用关系，旨在验证STM LT2 sRNA GcvB的靶标trpE基因，为GcvB的调控机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料试验菌株3409(STM LT2 wild)、10241(STM LT2 gcvB::cat)和10675(STM LT2 Hfq::tet)；Red同源重组系统涉及质粒pKD46为同源重组的辅助质粒,含有温度敏感复制子,≥37℃培养可去除，20%阿拉伯糖诱导后能够表达Gam、Beta和Exo 3个λ噬菌体重组酶;pKD13含卡那霉素(kn)抗性基因和FRT位点 (FLP重组酶识别位点)， 为重组转化子提供筛选标志;pCP21是含氨苄青霉素(Amp) 抗性和氯霉素(Cm)抗性基因的温度敏感型质粒,能够表达FLP重组酶,≥37℃培养可去除,该质粒用于消除FRT位点间的kn基因；pCE40为携带lac基因的质粒(lac基因表达半乳糖苷酶，lac基因无起始密码子，该基因上游4 nt处有单FRT位点，在FLP重组酶的作用下能与另单一FRT位点产生融合)；转导用的P22噬菌体，以上所有材料均由法国国家科学研究中心(CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠；pfu高保真酶和ONPG购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2trpE基因lac融合菌株的构建

1.2.1引物设计 P1和P2中下划线序列分别与trpE基因两翼同源，未加下划线部分与质粒pKD13 kn基因两侧同源，P5和P6位于trpE基因同源重组区两侧，P3和P7均来自trpE基因同源重组区上游侧，P4和P8分别来自于trpE基因插入的kn和lac序列，P9和P11分别来自于gcvB和Hfq同源重组区上游侧，P10和P12分别来自插入的(Con)和四环素(tet)抗性序列，引物送往上海英潍捷基生物科技有限公司合成(表1)。

表1 扩增所用引物

1.2.2打靶PCR产物的制备纯化 Touchdown PCR进行80 μL反应体系扩增。反应体系为：pKD13模板(10 mg/L)10 μL，引物P1和P2各1 μL，Pfu DNA Polymerase(5 U/μL)0.25 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL)0.75 μL，dNTPs Mix(10 mmol/L)2 μL，10×PFU Buffer 2 μL，10×Taq Buffer 6 μL，ddH2O 57 μL。反应条件：95℃ 6 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，循环5次；95℃ 10 s,53℃ 30 s，72℃ 90 s，循环20次；72℃ 8 min。产物取10 μL经琼脂糖凝胶电泳检测，若无特异性条带产生则将剩余产物用产物纯化试剂盒回收并测量DNA浓度。

1.2.3Red重组酶的诱导和第1次同源重组 按1∶100取3409过夜菌液于5 mL 液体LB中30℃培养至D600为0.4～0.6，10%甘油洗涤3次后50 μL 10%甘油悬浮即为电转化感受态细胞，将1 μL pKD46(浓度约为100 ng)与50 μL感受态细胞混合并转入0.1 cm的Bio-Rad电极杯中，按Bio-Rad电转仪预定参数2.5 kV 5.8 ms电击转化并迅速加入1 mL SOCS复苏液，将杯内液体转出并于摇床30℃ 170 r/min培养1 h，取200 μL涂布于Amp的LB平板，挑单个阳性菌30℃过夜培养并在26 μL 20%阿拉伯糖的诱导下制备40 mL菌液终体积100 μL 的电转化感受态细胞，取上述制备的PCR产物(质量浓度约为200 mg/L)5和50 μL感受态细胞混合电击，37℃复苏后取100 μL涂布于Kn抗性LB平板,挑单个菌落PCR及测序鉴定。

1.2.4FLP酶的诱导及专一性重组 将编码FLP专一性重组酶的质粒pCP21电转化入重组菌STM trpE::kn，涂布于Amp抗性平板30℃培养后，筛选阳性转化子，30℃制备感受态细胞，将质粒pCE40电转化入FRT疤痕重组菌株STM trpE::scar，涂布于Kn抗性平板37℃培养，筛选阳性转化子划线培养于Kn抗性麦康凯培养基。

1.3 噬菌体转导构建gcvB和Hfq基因的单缺失及双缺失制备P22肉汤：2 mL 50×E、1 mL 20%葡萄糖和0.1 mL P22噬菌体混合并用液体LB定容至100 mL。取2 mL P22肉汤与过夜培养的10241和10675各500 μL混合并于37℃过夜培养，转入2 mL 离心管12 000 r/min离心3 min并取上清加入3滴氯仿充分振荡，4℃静置1 h，20 μL上清加入1 mL LB 稀释，20 μL稀释后样本与过夜培养的重组菌STM trpE::lac混合后37℃ 170 r/min培养1 h，各取200 μL涂布于Cm、tet抗性和双抗平板37℃过夜培养，筛选相应阳性转化子，挑单个菌落划线至相应抗性LB平板培养，挑单个菌落划线至EBU平板直到验证噬菌体已丢失。

1.4 β半乳糖苷酶试验分别将trpE::laz、trpE::laz△gcvB、trpE::laz△Hfq和trpE::laz△Hfq△gcvB基因型菌株培养至对数早期(D600值为0.3～0.5)，准确测量并记录D600值，重复3次取平均值。设4个试验组，1个对照组，试验组将500 μL菌液与500 μL Z缓冲液混合于转导型玻璃管，对照组加入1 mL Z缓冲液。用巴斯德吸管向各组加入1滴甲苯并漩涡振荡30 s，于42℃恒温水浴2 h后立即转入28℃恒温水浴5 min，加入0.2 mL ONPG(4 g/L)并记录每个组的时间t0，待溶液变黄，加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应并记录时间tf，将各组溶液转入2 mL离心管12 000 r/min离心3 min，测量各组上清D420值，重复3次取平均值，带入公式1 000×D420/ (tf- t0)×0.5×D600计算β半乳糖苷酶活性。

1.5trpE基因与GcvB R1区作用位点的预测登陆网站(http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/)，输入分析对象(Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2)，输入GcvB R1区共识序列 (TTGGCTTACGGTTGTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGCAATTGGT-CTGCG),mRNA匹配区域为-70～+30 nt，sRNA窗口大小数值为13，最小杂交种子数为7，P值最大阈值为0.05，过滤尺寸值为400，点击搜索并导出结果。

2 结果

2.1trpE基因lac融合菌株的构建及PCR鉴定利用Red同源重组系统将lac与STM LT2 wild株候选基因trpE融合，结果显示，STM LT2 trpE::lac菌株经特异性引物PCR扩增后，出现与预期相符大小为757 bp的条带(图1)，经深圳华大生物科技有限公司的扩增产物测序结果也与预期相符，接种麦康凯固体培养基能分解半乳糖苷呈现红色菌落(图2)，该菌株被命名为PY1,本试验成功构建STM LT2trpE基因lac融合菌株。

图1 STM LT2 trpE基因lac融合的PCR检测结果 M．DL2000 DNA Marker；1.STM LT2 trpE::lac样本；2.空白对照

2.2gcvB和Hfq基因单缺失及双缺失株的构建及PCR鉴定利用噬菌体转导技术敲除PY1菌株的gcvB和Hfq基因，结果显示，PY1△gcvB、PY1△Hfq和PY1△Hfq△gcvB菌株经特异性引物PCR扩增后，分别出现与预期相符的696和826 bp条带(图3)，经深圳华大生物科技有限公司的扩增产物测序结果也与预期相符，PY1△gcvB、PY1△Hfq和PY1△Hfq△gcvB分别被命名为PY11、PY12和PY13。本试验成功构建PY1菌株基因gcvB和Hfq的单缺失及双缺失。

图2 STM LT2 trpE基因lac融合菌株麦康凯固体培养基培养结果 A.空白对照；B.STM LT2 trpE::lac样本

图3 PY1菌株gcvB和Hfq基因的单缺失及双缺失PCR检测结果 M.DL2000 DNA Marder;1.空白对照；2.gcvB缺失样品；3.Hfq缺失样品

2.3 β半乳糖苷酶试验检测trpE基因的表达通过测定PY1、PY11、PY12和PY13菌株的半乳糖苷酶活性。结果显示，PY11和PY12相比PY1分别增加了1.2和1.1倍，而PY13增加仅0.5倍(图4)，而这与转录组分析结果中STM LT2gcvB或Hfq基因的缺失导致trpE基因转录水平分别上调2.2和2.4倍的趋势一致。结果表明，GcvB和Hfq调节trpE基因的蛋白表达。

2.4 GcvB R1区与trpEmRNA的相互作用位点TargetRNA2系统预测STM LT2 GcvB R1区与trpEmRNA的相互作用位点，结果显示trpEmRNA +2 nt至+9 nt富含CA的区域能与GcvB富含GU的R1区72～97 nt的区域形成8个连续或18个不连续的碱基互补(图5)。结果表明，trpE基因极有可能受GcvB的直接调控 。

图4 Hfq和gcvB基因缺失对trpE-lac融合蛋白表达影响

图5 GcvB R1区与trpE mRNA相互作用预测结果

3 讨 论

此前，SITTKA等[13]利用高通量焦磷酸测序(HTPS)技术对Hfq基因缺失的STM LT2进行转录组分析，结果显示，Hfq控制着所有STM LT2基因近1/5表达。本研究室前期对STM LT2基因gcvB和Hfq基因敲除的转录组分析结果显示，GcvB和Hfq共同调控着所有STM LT2基因近1/10的表达，足以证明sRNA GcvB对STM LT2的重要，通过将该1/10的基因与SHARMA等[5-6]和URBANOWSKI等[14]所鉴定的GcvB靶标进行比较，结果表明，本项研究结果并未包含所有已被鉴定的靶基因，提示GcvB在基因转录后调控作用机制中或许有不影响mRNA的稳定性但影响mRNA正常翻译的情况出现，GcvB的这种作用机制尚未见报道，值得探究。GULLIVER等[15]最新研究表明，对多杀性巴氏杆菌的Hfq和gcvB基因缺失株进行转录组和蛋白质分析时发现，转录水平未发生改变的基因却在蛋白水平发生了改变，而蛋白组分析产生差异表达的基因数量大于转录组。

随着生物信息学分析工具越来越成熟，利用得当便事半功倍， TargetRNA2是一台网络服务器，可识别细菌中sRNA调控的mRNA靶标，该系统被KERY等[16]开发并通过测试评估，评估结果显示，其命中已知GcvB靶标的能力优于其他所有系统。在该系统预测GcvB R1区对trpE mRNA的作用中发现，trpE基因是评分最高的基因，该基因此前由SHARMA[5]等通过比较脉冲表达的方法鉴定到其受GcvB R1区的影响，但由于构建的报告基因荧光低，无法通过gfp融合得到证实。另一个有趣的现象是预测R1区与trpEmRNA能够形成8个连续或18个相邻碱基互补，而这18个碱基跨越了trpEmRNA的5′UTR及CDS区，这与此前已发表文章报道过的GcvB作用于靶mRNA 5′UTR核糖体结合位点或邻近核糖体结合位点上游的区域不同，该配对区域覆盖了trpEmRNA 起始密码子AUG，这种作用机制目前尚未见相关研究报道，若该机制被证实，将进一步刷新sRNA的调控方式。

lac融合被广泛用于验证基因蛋白表达水平的变化[17-18]，由ELLERMEIRE等[10]开发的一种结合λRed和FLP同源重组系统将携带lac序列但无起始密码子(ATG)的质粒pCE40巧妙的与目的基因FRT疤痕融合，与目的基因共用5′UTR功能区以及起始密码子 (ATG)。成功构建的lac融合便能进行β半乳糖苷酶试验，测定其表达的β半乳糖苷酶的活性，从而间接定量该基因蛋白表达的水平。该研究前期猜测GcvB和Hfq对trpE基因的蛋白表达产生抑制作用，如β半乳糖苷酶试验结果所示，GcvB和Hfq单缺失时trpE基因的表达得到了提升，若与预期相符，当GcvB和Hfq同时缺失时trpE基因的表达水平应高于任一单缺失，但结果表明，GcvB和Hfq的双缺失没有带来更高的提升，相反，trpE基因的表达水平与对照组相近，仅提升0.5倍。产生该现象的原因推测为当trpE基因的转录或蛋白表达无法受到来自GcvB或Hfq的抑制时，第3种调控trpE基因转录或翻译的机制将被激活，而这种机制可能受GcvB或Hfq的负调控，该机制值得进一步探究。