三种慢性胰腺炎胰腺纤维化大鼠模型的对比研究

邵璐 叶蔚 魏霞

[摘要] 目的 观察与比较二乙基二硫代氨基甲酸盐（DDC）高剂量恒量腹腔注射、DDC递增法腹腔注射、二丁基二氯化锡（DBTC）一次性尾静脉注射三种慢性胰腺炎胰腺纤维化大鼠造模方法。 方法 48只SD大鼠随机分成生理盐水腹腔注射组（对照组）、DDC高剂量恒量腹腔注射组（DDC恒量组）、DDC递增法腹腔注射组（DDC递增组）、DBTC一次性尾静脉注射组（DBTC组）。采取相应的造模措施，4周后处理大鼠，全自动生化分析仪检测血淀粉酶，ELISA 法检测透明质酸，HE染色及Masson染色检测胰腺组织病理学，并进行病理评分和纤维化评分。 结果 DBTC组大鼠存活率低于对照组（P<0.05），其他各组间相比均无统计学差异（P均>0.05），三组造模组血淀粉酶、透明质酸、病理评分、纤维化评分均显著高于对照组（P均<0.01），其中DDC恒量组与DDC递增组相比组间无差异，DBTC组高于其他各组（P均<0.05）。 结论 DBTC一次性尾静脉注射法造模的大鼠胰腺纤维化最显著，比较符合人类慢性胰腺炎的发病机制和病理组织学改变。

[关键词] 慢性胰腺炎;胰腺纤维化;大鼠模型;病理评分

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）24-0031-04

[Abstract] Objective To observe and compare three kinds of chronic pancreatitis models of rats with pancreatic fibrosis：high dose and constant intraperitoneal injection of diethyldithiocarbamate（DDC）， intraperitoneal injection of DDC incremental method and one-time tail vein injection of dibutyltin dichloride（DBTC）. Methods 48 SD rats were randomly divided into three groups：normal saline intraperitoneal injection group（Control group）， DDC high dose constant intraperitoneal injection group（DDC constant group）， DDC incremental intraperitoneal injection group（DDC incremental group） and DBTC one-time tail vein injection group（DBTC group）. After 4 weeks， the rats were treated， the amylase in blood was detected by automatic biochemical analyzer， hyaluronic acid was detected by ELISA， the histopathology of pancreas was detected by HE staining and Masson staining， and the pathological score and fibrosis score were made. Results The survival rate of rats in DBTC group was lower than that in the control group（P<0.05）， and there was no statistical difference among other groups（P>0.05）. The serum amylase， hyaluronic acid， pathological score and fibrosis score in the three groups were significantly higher than those in the control group（P<0.01）. There was no difference between DDC constant group and DDC increasing group，and DBTC group was higher than other groups（P<0.05）. Conclusion The pancreatic fibrosis induced by DBTC is the most significant in rats，which is consistent with the pathogenesis and histopathological changes of human chronic pancreatitis.

[Key words] Chronic pancreatitis; Pancreatic fibrosis; Rat model; Pathological score

慢性胰腺炎（Chronic pancreatitis，CP）是消化系統的常见疾病，由多种原因引起的胰腺组织和功能反复或持续性的损害，造成不可逆转改变的一种慢性炎性疾病[1]，其主要的病理特征为胰腺纤维化[2]，临床常表现为反复发作的腹痛及内、外分泌功能不全[3]。迄今为止，国内外诸多学者已经制备了各种CP的动物模型，但尚未有一种模型能够完全复制出人类CP的整个病理生理过程。研究出一种更为理想的CP动物模型，可为进一步研究慢性胰腺炎提供良好的基础。本实验旨在初步比较并评价二乙基二硫代氨基甲酸盐（DDC）高剂量恒量腹腔注射、DDC递增法腹腔注射、二丁基二氯化锡（DBTC）一次性尾静脉注射三种慢性胰腺炎胰腺纤维化造模方法，为胰腺纤维化的动物模型的制备提供更好的选择。

1 材料与方法

1.1 材料来源

SPF级雄性SD大鼠，体重180～200 g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。二丁基二氯化锡（DBTC）购自Sigma公司，二乙基二硫代氨基甲酸盐（DDC）购自Sigma公司，手术器械由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 分组与造模方法

普通饲料喂养1周后开始实验，实验前12 h起禁食不禁水。按随机数字表法将大鼠分为生理盐水腹腔注射组（对照组）、DDC高剂量恒量腹腔注射组（DDC恒量组）、DDC递增法腹腔注射组（DDC递增组）、DBTC一次性尾静脉注射组（DBTC组），每组12只。所有大鼠均喂以标准颗粒饲料，自由饮水。实验时间为4周。对照组给予生理盐水10 mL/（kg·次）腹腔内注射;DDC恒量组予DDC 1000 mg/（kg·次）;DDC递增组首次给予DDC 400 mg/kg，以后每次注射的剂量在上次注射剂量的基础上递增10%。各组均每周注射2次，共8次，注射部位为SD大鼠右下腹外侧，DBTC组予DBTC 8 mg/kg。

1.3 标本获取与处理

末次给药当晚大鼠禁食不禁水，次日上午空腹以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹腔静脉取血，分离血清，用于血清学检测，采用全自动生化分析仪检测血淀粉酶，按试剂盒说明采用ELISA法检测透明质酸;取胰腺组织，以4%多聚甲醛固定，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋待用。常規伊红-苏木素（HE）染色，对胰腺水肿、炎症、出血、坏死进行病理评分，应用Masson染色法对胰腺胶原纤维染色。

1.4 病理评分标准

由两位资深的病理科专科医师通过多人共览显微镜阅片，不同放大倍数全面评估，每张切片随机选取5个高倍视野，观察胰腺组织病理变化，根据胰腺病理评分标准[4，5]：①炎症细胞浸润：5个HP内均值<5个为0分，6～20个为1分，21～40个为2分，>40个为3分;②坏死：无为0分，小灶性坏死为1分，小片状坏死为2分，大片状坏死为3分;③结构破坏：无为0分，灶性结构破坏为1分，部分结构破坏为2分，大部分结构破坏为3分;④黏液水肿：无为0分，有为1分;⑤腺泡萎缩：无为0分，有为1分;⑥纤维化：采用Masson染色，染色结果用美国Image-Pro Plus专业彩色图像分析软件进行分析，在400倍视野下，选取标本四角和中央5 个视野，测定每一视野中胶原纤维含量， 以纤维占视野面积的百分比表示胶原含量， 取其平均值进行统计分析。5个HP内胶原纤维所占面积的均值<1.0%为0分，1.1%～5.0%为1分，5.1%～10.0%为2分，10.1%～20.0%为3分，>20.0%为4分。根据以上分值之和，0～3分为正常，4～6分为轻度CP，7～9分为中度CP，>9分为重度CP。

1.5 统计学处理

采用SPSS21.0统计学软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠存活情况

连续观察4周，对照组大鼠全部存活，DDC恒量组36 h死亡2只，5 d、6 d各死亡1只，DDC递增组6 d、8 d、12 d各死亡1只，DBTC组24 h死亡3只，48 h、5 d各死亡1只，DBTC组存活率低于对照组（P<0.05），其他各组间相比均无统计学差异（P均>0.05），见表1。

2.2 各组大鼠一般情况

对照组大鼠在整个实验过程中，饮食、饮水、二便均未出现明显异常，体重不断增长，毛发有光泽，精神矍铄，活动频繁;DDC恒量组大鼠饮水、饮食、排尿正常，大便偏稀，脱毛，毛色光泽度欠佳，精神尚可，活动有所减少;DDC递增组饮水略增加，进食减少，活动减少，精神萎靡，部分肢体出现震颤，毛稀疏，毛色光泽度欠佳，体重增加缓慢;DBTC组第2天开始出现倦卧、少动、食量减少、饮水增加、背毛蓬松失去光泽等，部分大鼠出现稀便、肛周污染，部分出现眼睛、鼻、爪甲出血，有时出现烦躁不安，体重缓慢增加，尾巴溃烂甚至断落，其中死亡的大鼠共同特征为四肢消瘦，腹部膨隆，双眼、前后爪甲黄染，尿色加深，大便陶土样。

2.3 各组大鼠血淀粉酶、透明质酸比较

三组造模组血淀粉酶水平及透明质酸水平均显著高于对照组（P均<0.01），其中DDC恒量组与DDC递增组相比组间无差异，DBTC组高于其他各组（P均<0.05），见表2。

2.4 大鼠胰腺病理及胶原染色情况

2.4.1 大体观察  对照组：大鼠胰腺组织饱满，呈粉红色，质地柔软，表面光滑，胰胆管及血管分布规则，与周围组织无粘连。DDC恒量组：大鼠胰腺组织轻至中度水肿，色泽略苍白，质地稍硬，缺乏光泽，体积改变不明显，部分胰腺有散在陈旧性出血点及点灶状局部坏死，与周围组织无明显粘连。DDC递增组：大鼠胰腺组织中至重度水肿，色泽苍白，质地较硬，无光泽，体积缩小，表面可见局限性硬结节形成，与周围组织物无明显粘连。DBTC组：大鼠胰腺组织中至重度水肿，色泽苍白，质地僵硬，无光泽，萎缩，表面广泛硬结节形成，可见胰管、胆管扩张，腹腔内有黄色液体积聚，与脾脏或胃有粘连，其中1例14 d死亡的大鼠还可见肝脓肿形成。

2.4.2 镜下组织学观察  对照组大鼠胰腺腺泡、胰岛、导管、血管、小叶间隔等结构完整，排列规则，间隔紧密，部分可见少许慢性炎细胞浸润或是有少量充血。DDC恒量组、DDC递增组、DBTC组大鼠均可见小叶间及小叶内有较多急慢性炎细胞浸润，间质充血水肿明显，小叶间隔增宽，部分可见腺泡坏死、萎缩，局部脂肪空泡样变性、细胞核碎片沉积，并有较多纤维组织及肉芽组织增生（封三图2）。但是以DBTC组大鼠纤维化最显著，胶原纤维交织成网状，呈弥漫性增生。

三组造模组病理评分、纤维化评分均显著高于对照组（P均<0.01），其中DDC恒量组与DDC递增组相比组间无差异， DBTC组显著高于其他各组（P均<0.01），见表3。

3 讨论

目前研究表明，慢性胰腺炎的发病原因复杂，在我国主要以胆源性疾病引起的胆管狭窄或梗阻为主[6]，而长期酗酒是欧美国家的主要病因，但是随着人们生活方式的改变，近年来慢性酒精中毒诱发的慢性胰腺炎在我国的发病率呈逐年上升的趨势[7]。CP在组织病理学上主要表现为不可逆转的内外分泌细胞的逐渐减少、纤维化形成、导管上皮和腺上皮特有的形态学改变，其中胰腺纤维化是以大量细胞外基质沉积和分布改变为主要的病理学特征。众所周知，慢性肝炎纤维化患者的血清透明质酸可明显增高，同样，在慢性胰腺炎纤维化患者中，也可以检测到血清透明质酸升高，这是活动性炎症导致细胞外基质动态代谢变化的标志[8]。故本实验选取血清透明质酸指标以评估细胞外基质代谢程度。Masson染色在结缔组织中是最常用的染色方法，主要区分胶原纤维和肌源纤维，因此在组织器官纤维化程度检测中具有重要意义。胰腺外分泌障碍可出现腹胀、纳差、消化不良、脂肪泻、体重下降等临床表现。

如何选择较理想的CP动物模型，以便更好指导今后的研究，为更多的研究者指明方向。目前已研究出多种CP的动物模型，但是仍与人类的CP发生发展存在一定的差距。其中较成熟的造模方法有食物诱导法[9]、胰胆管注射法[10]、胰胆管结扎法[11]、腹腔注射法[12]、尾静脉注射法[13]等，食物诱导法所需的造模周期最长，而胰胆管注射法及结扎法需要手术操作，技术含量较高，且术后并发症较多，影响大鼠的存活率，干扰实验结果。其中胰胆管注射有三硝基苯磺酸（TNBS）[14]。故本研究选择几种操作较为简便、造模周期短、成本低廉等优点的腹腔注射法和尾静脉注射法进行比较。腹腔静脉注射的药物目前研究较多的有DDC[15]、L-精氨酸（L-arginine）[16]、雨蛙肽[17]等，尾静脉注射的药物较多的有DBTC[13]。本实验研究表明DBTC组大鼠在一般情况、血淀粉酶和透明质酸水平、胰腺大体组织、病理评分和纤维化评分方面，均显著优于各组，差异有统计学意义（P<0.05），DDC递增组与DDC恒量组相比无统计学差异。可见DDC恒量腹腔注射法和递增腹腔注射法胰腺的纤维化不明显，DBTC一次性尾静脉注射法胰腺的纤维化最显著，但不足之处是，DBTC对其他脏器也有损伤作用，如何避免急性期对胰腺外周边脏器的损伤，减少死亡率，仍需进一步研究。DBTC是一种脂溶性物质，通过尾静脉注射进入动物体内后，可经肝脏、胆囊排泄至胰胆管，引起胰胆管细胞坏死和上皮增生，坏死物和增生物脱落聚集，进而阻塞胰胆管，造成急性胆源性的胰腺炎，随后转为慢性胰腺炎，最后形成纤维化[18-20]。本实验DBTC组大鼠出现胆管扩张肿大，腹腔内大量胆汁样积液，身目黄染、尿黄、大便陶土色等梗阻性黄疸表现，模拟通过引起胰腺组织坏死与炎症，造成胰腺组织损伤、修复与纤维化的过程，无论是从胰腺功能障碍，还是对胰腺病理学改变的影响，均比较符合人类CP的发病机制和病理组织学改变，因此是较为理想的CP纤维化模型。Merkord J等[13]采用DBTC一次性尾静脉法成功复制出大鼠CP模型，观察到CP纤维化的发展过程，成功率达80%，与本研究结果符合，此造模方法具有可复制性。

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（收稿日期：2019-11-05）