养阴清咽颗粒质量标准的提高研究

陈金锋，姜 蕾，刘国彬

养阴清咽颗粒为安徽省六安市中医院放疗科特色医院制剂，由金银花、芦根、玄参、生地、白花蛇舌草等十味中药组成，方剂组成简洁，疗效明确，具有养阴利咽、清热生津、解毒散结、消肿生肌的功能。目前临床主要用于肿瘤病人放疗口咽部位损伤进而表现为热毒伤阴或毒伤血络，甚则热壅肉腐等证。养阴清咽原质量标准质量控制覆盖面不广，质量标准较低，为更全面控制养阴清咽颗粒质量，我们采用色谱方法对养阴清咽颗粒中金银花、玄参、甘草、白花蛇舌草、桔梗五种药味进行定性鉴别，对养阴清咽颗粒中绿原酸进行含量测定，进一步完善该制剂的质量标准。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，G1316A紫外检测器)；BT125D型电子分子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-5200DA型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；瑞士CAMAG-LINOMA温度-4手动点样仪、瑞士CAMAG薄层色谱点样专用毛细管、CAMAG紫外观察箱、YOKO-XR薄层加热器、高效硅胶G薄层板。

1.2 试药 养阴清咽颗粒由安徽省六安市中医院制剂室提供(批号为20180626、20180823、20180914)；绿原酸对照品、哈巴俄苷对照品、甘草对照药材、桔梗对照药材、白花蛇舌草对照药材购自中国食品药品检定研究院(批号依次为110736-201337、111730-201106、120904-201318、121028-201210、121183-201605)；无水乙醇、甲醇、磷酸、乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、冰醋酸、三氯甲烷、氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；阴性样品为自制。

2 方法及结果

2.1 金银花的鉴别

2.1.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Agilent TC-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(13∶87)，流速：1.0 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液的制备 (1)供试品溶液：取本品适量，研细，称取0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，称定重量，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。(2)对照品溶液：精密称取绿原酸对照品适量，加50%甲醇制成1 mL含80 μg的溶液，即得。(3)阴性对照溶液：按处方比例，称取除金银花外的其他12味药材各一份，按养阴清咽颗粒制备工艺和供试品溶液制备方法制备缺金银花阴性样品溶液。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果显示在与绿原酸对照品色谱图相应位置上，缺金银花阴性对照无干扰峰(见图1)。

2.1.3.2 重复性验证 取对照品溶液、3批供试品溶液及阴性对照溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果显示3批供试品色谱中均检出绿原酸，方法重复性较好，因此建议将金银花纳入质量标准(见图2)。

2.2 玄参的鉴别[1]取本品10 g，研细，加甲醇40 mL，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次30 mL，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤4次，每次30 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按供试品制备方法制备缺玄参对照药材溶液，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版通则0502)试验，吸取供试品溶液8 μL，对照品溶液3 μL，阴性对照溶液8 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰(见图3)。

2.3 甘草的鉴别[2]取本品10 g，研细，加甲醇50 mL，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙醚萃取3次，每次20 mL，弃去乙醚液，加入水饱和正丁醇20 mL，萃取3次，合并正丁醇液，用正丁醇饱和水洗涤3次，每次20 mL，弃去正丁醇饱和水，水饱和正丁醇液蒸干，加甲醇10 mL使溶解，过10 g中性氧化铝(100～200目，内径1.5 cm)柱，先用40 mL甲醇洗脱，弃去洗脱液，再用40%甲醇60 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干。残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1 g，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇30 mL，超声处理使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1mL使溶解，作为对照品溶液。按供试品制备方法制备缺甘草对照药材溶液，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版通则0502)试验，吸取上述供试品溶液7 μL，对照品溶液3 μL，阴性对照溶液7 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾出，喷以10%硫酸乙醇溶液。在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视(见图3)。

2.4 白花蛇舌草的鉴别[3]取本品30 g，研细，加无水乙醇30 mL，浸渍30 min，滤过，滤液浓缩至0.5 mL，作为供试品溶液。另取白花蛇舌草对照药材3 g，加水50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液浓缩至约15 mL，加乙醇30 mL，浸渍30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇5 mL使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照品溶液。按供试品制备方法制备缺白花蛇舌草对照药材溶液，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版通则0502)试验，吸取供试品溶液2～3 μL、对照品溶液2 μL，阴性对照溶液2～3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙醇-浓氨试液(7.5∶7.5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5 mol/L盐酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰(见图3)。

2.5 桔梗的鉴别[4]取本品5 g，加7%硫酸乙醇-水(1∶3)的混合溶液20 mL，加热回流3 h，放冷，过滤，滤液用三氯甲烷提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，加水洗涤2次，每次30 mL，弃去洗液，三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取桔梗对照药材1 g，同法制得对照品溶液。按供试品制备方法制备缺桔梗对照药材溶液，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版通则0502)试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙醚(1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰(见图3)。

2.6 绿原酸的测定

2.6.1 色谱条件 同“2.1.1”条件。

2.6.2 溶液制备 (1)供试品溶液制备：取本品适量，研细，称取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，称定重量，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。(2)对照品溶液制备：同 “2.1.2”制备方法。(3)阴性对照溶液制备：同“2.1.2”制备方法。

2.6.3 方法学考察

2.6.3.1 专属性实验 操作同“2.1.3.1”项下实验进行，结果见图1。

2.6.3.2 标准曲线的制备 精密移取绿原酸对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。照上述色谱条件，各精密吸取10 μL注入液相色谱仪，每个浓度进两针，记录峰面积值。以绿原酸进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=2 968.7X-22.077，R2= 0.999 9。表明绿原酸进样量在0.236～2.360 μg之间与峰面积线性关系良好。

2.6.3.3 精密度实验 精密称定绿原酸对照品1.15 mg至10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，连续进6针，具体见表1。

表1 精密度试验结果

2.6.3.4稳定性实验 取本品适量，研细，取约2.001 4 g，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，称定重量，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，做为供试品溶液。分别在0、2、4、6、8、12 h精密吸取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，结果表明本品在12 h内基本保持稳定，RSD%=0.4%(见表2)。

表2 稳定性试验结果

2.6.3.5 重复性实验 精密称取样品6份，分别依法制备供试品溶液，分别进样10 μL，记录峰面积值。测得绿原酸平均含量分别为1.36、1.37、1.40、1.41、1.36、1.37 mg/g，RSD%=1.53%(n=6)，说明本方法重复性良好。

2.6.3.6 加样回收率实验 取供试品6份，每份约5 g，分别加绿原酸对照品约1.5 mg，按供试品制备方法进行制备。分别进行液相测定，记录峰面积值，计算回收率，所得回收率为97.79%，RSD%=1.17%(见表3)。

表3 加样回收率试验结果

2.6.3.7 样品含量测定 取6批供试品，按供试品溶液制备的方法制备样品溶液，结果表明，养阴清咽颗粒中绿原酸的含量分别为1.45、1.41、1.41、1.35、1.33、1.34 mg/g。

3 讨论

高效液相色谱法(HPLC)是目前药物及制剂常用的一种定量定性方法，该方法适用范围广，分析速度快，分离效能高、灵敏度高，在药物分析及药品质量控制中占有非常重要的地位[5]。色谱柱性能不断提高，这就要求HPLC配备更高效的检测器，还可与多种检测器联合应用，如HPLC与原子荧光、四级杆飞行时间质谱、核磁共振技术联用等[6-8]。

养阴清咽颗粒前期质量标准不完整，为进一步完善养阴清咽颗粒的质量标准，本实验继续对养阴清咽颗粒中金银花、牡丹皮等药物进行色谱鉴别研究。生地黄、牡丹皮背景干扰严重；薏苡仁的色谱鉴别研究发现，阴性对照有干扰；白及、芦根的供试品色谱，在与对照品和对照药材色谱中相应位置上无对应斑点；金银花、玄参、甘草、桔梗阴性无干扰，方法重复性较好，建议将金银花、玄参、甘草、桔梗纳入质量标准。

实验初期拟采用薄层色谱法对养阴清咽颗粒中金银花进行鉴别，样品处理方法复杂，且效果仍不理想，背景干扰严重，故放弃薄层色谱法，采用HPLC对其进行鉴别。养阴清咽颗粒中金银花色谱鉴别处理方法采用了超声提取，方法简单。经过多批制剂重复性实验及阴性对照实验，结果发现金银花鉴别方法操作简便可行，节约了时间及成本。

质量标准仅通过薄层色谱法对玄参、甘草、桔梗鉴别，鉴别方法单一，不够全面，本实验进一步以绿原酸作为质控指标，采用HPLC对金银花药味中绿原酸进行鉴别，检验方法重复性好，专属性强，拓宽了养阴清咽颗粒的控制指标，较为全面反映养阴清咽颗粒的内在质量，进一步完善了该制剂的质量标准。