紫杉醇长循环纳米胶束联合vMIP-ⅡN端肽逆转乳腺癌细胞耐药的研究

董正远，许河南，王文锐，杨清玲，陈昌杰

乳腺癌作为女性中最常见的癌症，占女性癌症死亡原因的第二位[1]，对女性健康造成了极大的威胁。目前乳腺癌的治疗手段主要包括手术治疗、放疗、化疗及内分泌治疗等[2-5]。紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮中分离的天然次生代谢产物，在多种癌症中具有广泛的活性，包括乳腺癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌[6]，但作为转移性乳腺癌一线化疗药物，仍然存在一些缺陷，如水溶性较差、生物利用度比较低以及较高的化疗不良反应等。纳米药物是使用纳米微粒作为载体来搭载药物，使药物和纳米颗粒结合而制成的药物，相对于常规药物具有粒径较小、催化效率高、吸附能力较强、活性中心多等优点。本研究分析紫杉醇长循环纳米载药胶束在乳腺癌耐药细胞中的作用，并探讨其联合病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)N端肽(NT21MP)的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7于中科院细胞库购买；构建耐药细胞所用药物为紫杉醇；PEG2000-DPE于艾韦特公司购买；胎牛血清、DMEM高糖培养基于Hyclone公司购买；BAX、BCL-2、caspase3、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、snail、Slug、P-gp、BCRP、MRP抗体于Proteinteche公司购买；细胞凋亡试剂盒于Muse公司购买；细胞周期试剂盒于江苏凯基生物公司购买；β-actin抗体于武汉博士德公司购买；维生素E-聚乙二醇琥珀酸酯1000(TPGS)于阿拉丁生化公司购买；BCA-试剂盒于碧云天生物公司购买。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用紫杉醇递增浓度梯度诱导MCF-7细胞耐药性的产生，使MCF-7细胞处于10 μg/mL的紫杉醇浓度中稳定生长。培养细胞均用含有10%的胎牛血清的DMEM高糖培养基，并在5%CO2、37 ℃的环境下培养。所有用于实验的细胞均处于对数生长期。当细胞融合度至90%左右时，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化离心并传代。

1.2.2 细胞增殖实验 采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)染色法检测细胞增殖的活性，将对数生长期的细胞消化种在96孔板中，加药处理24 h后，吸出培养基，每孔加入200 μL 10%的三氯乙酸(TCA)溶液固定，100 μL 0.4%的SRB溶液染色。用1%乙酸溶液反复洗涤，每孔分别加入150 μL 10 mmol/L的 Trisbase溶液，置于脱色摇床上剧烈摇动15 min。在515 nm波长下检测吸光度。存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)。

1.2.3 划痕实验 检测细胞迁移能力，收集处于对数生长期的细胞，制备成单个细胞的混悬液，均匀的接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞密度长至90%且细胞处于对数生长期时，用10 μL无菌枪头垂直地在6孔板内划两道宽度均匀的直线，同时保证每孔内直线的宽度一致。吸去6孔板内的培养液，用PBS轻柔洗涤细胞2次后，再进行加药处理，处理完后随即拍照记录0 h的直线宽度，将6孔板放置于5% CO2、37 ℃培养箱内继续培养24 h，在24 h时观察并拍照记录直线宽度。

1.2.4 Transwell实验 检测细胞侵袭能力，将处于对数生长期的细胞铺在6孔板中，当细胞融合度达到80%时对细胞进行处理，离心后重悬细胞。Transwell小室预先用60 μL的稀释的Matrigel基质胶处理好备用。向24孔板中加入600 μL含10%胎牛血清培养基，在上室加入100 μL的细胞悬液，24 h后取出小室弃上清，用棉签轻柔的擦去上室里未穿过的细胞。在下室中加入600 μL 4%的多聚甲醛固定细胞30 min。瑞氏-吉姆萨染液染色后，用高倍镜观察细胞数量。

1.2.5 细胞周期实验 将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化下来制成单细胞悬液，接种在6孔板中，置于5%CO2、37 ℃培养箱中孵育。当细胞密度达到80%进行不同分组的加药处理，继续置于5%CO2、37 ℃培养箱中孵育过夜。将细胞消化离心(1 000 r/min)5 min后弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞，70%乙醇固定细胞，置于4 ℃冰箱过夜。1 000 r/min离心5 min后弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次，继续离心后弃上清。每组加入50 mg/mL碘化丙啶(PI)染液500 μL和100 μg/mL RNase A 2 μL，室温避光染色30 min。用300目的尼龙网将细胞悬液过滤，上机检测细胞周期情况。

1.2.6 细胞凋亡实验 将处于对数生长期的细胞接种在6孔板中，5% CO2、37 ℃的培养箱中孵育过夜。细胞密度达到80%时进行实验处理，继续孵育24 h。用不含EDTA的胰蛋白酶将细胞消化后离心(1 000 r/min)5 min，弃清液。预冷的PBS洗涤细胞2次，弃清液，调整细胞密度约5×105个/毫升，取细胞悬液50 μL，加入同等体积的细胞凋亡试剂，室温避光30 min。300目的尼龙网过滤细胞悬液，上机检测细胞的凋亡情况。

1.2.7 Western blotting实验 配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，在每孔中加入25 μg的蛋白。设置恒定电压70 V，当蛋白跑到浓缩胶与分离胶的交界处时将电压调至100 V，直到溴酚蓝条带跑至分离胶边缘时，停止电泳。PVDF膜浸泡在甲醇溶液中激活；200 mA转膜1.5～2 h。将转膜好后的PVDF膜放于封闭液中封闭2 h。将膜浸泡在对应的一抗中4 ℃过夜。将PVDF膜浸泡在二抗中并置于37 ℃水浴2 h，用TBS洗膜3次后加入显影剂上机曝光。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 乳腺癌耐药细胞增殖情况 空白纳米胶束载体对乳腺癌耐药细胞株没有明显细胞毒性，不同浓度紫杉醇胶束组的细胞存活率均低于紫杉醇组，紫杉醇胶束联合NT21MP组的细胞存活率更低(P<0.01)(见表1)。

表1 不同药物对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/PR增殖的影响

2.2 乳腺癌耐药细胞迁移、侵袭情况 与空白纳米胶束组比较，NT21MP以及紫杉醇处理组细胞的迁移、侵袭能力下降，紫杉醇纳米胶束较单独紫杉醇处理的乳腺癌耐药细胞的迁移、侵袭能力进一步下降(P<0.01)，且以紫杉醇纳米胶束联合多肽NT21MP作用更加明显(P<0.01)(见图1、表2)。

表2 不同药物对乳腺癌耐药细胞迁移、侵袭能力的影响

2.3 乳腺癌耐药细胞凋亡、周期情况 与空白纳米胶束组比较，紫杉醇和NT21MP处理组乳腺癌细胞凋亡的数量和G2/M期细胞数量增加，紫杉醇纳米胶束组较紫杉醇处理组乳腺癌细胞的凋亡率和G2/M期细胞数量进一步增加(P<0.01)，且以紫杉醇纳米胶束联合NT21MP组更为显著(P<0.01)(见图2、表3、表4)。

表3 不同药物对乳腺癌耐药细胞凋亡的影响

表4 不同药物对乳腺癌耐药细胞周期的影响

2.4 乳腺癌耐药细胞的耐药及凋亡相关蛋白情况 与紫杉醇组相比，紫杉醇纳米胶束可以明显下调抑凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平，并促进凋亡相关蛋白Bax、caspase3的表达上升(P<0.01);紫杉醇纳米胶束联合多肽NT21MP进一步下调乳腺癌耐药细胞中Bcl-2蛋白的表达量，增加caspase3和Bax的蛋白表达(P<0.01)；紫杉醇纳米胶束对耐药蛋白P-gp、BCRP的抑制能力强于紫杉醇，且以紫杉醇纳米胶束联合NT21MP作用更显著(P<0.01)(见图3、表5)。

表5 不同药物对乳腺癌耐药细胞的耐药及凋亡相关蛋白表达的影响

2.5 乳腺癌耐药细胞上皮间充质转化(EMT)相关蛋白表达情况 与紫杉醇组比较，紫杉醇纳米胶束组EMT相关标志物E-cadherin蛋白表达水平明显上调，Vimentin、Slug蛋白表达水平下调，且以紫杉醇纳米胶束联合NT21MP作用更显著(P<0.01)(见图4、表6)。

表6 不同药物对乳腺癌耐药细胞EMT相关蛋白表达的影响

3 讨论

紫杉醇在临床上是治疗乳腺癌和卵巢癌的一线药物，虽然效果显著，但其难溶于水，且药物利用率较低[7-10]。随着纳米技术的不断发展，纳米技术在医药领域被广泛应用。纳米药物是使用纳米微粒作为载体搭载药物，使药物和纳米颗粒结合而制成的药物。与常规药物相比，纳米材料搭载的药物具有提高药物的效率、稳定性，增强药物的靶向作用、溶解度以及药物控释等优点。由于纳米载体修饰药物方式的多样化，使药剂型具有更大的发展空间和巨大潜能。

PEG2000-DSPE载药胶束是一种高分子化合物，胶束粒径均一，能够增加细胞摄取，且具有抗肿瘤活性，对正常组织毒性作用较小。同时PEG2000-DSPE载药胶束制剂实现了靶向、缓释给药，延长了血循环时间，还可以提高化疗药物溶解性和药效，保护药物免于降解[11]。因此，PEG2000-DSPE纳米胶束常被应用于难溶或不溶性药物的增溶剂，是一种良好的抗肿瘤药物纳米胶束载体。TPGS是一种新型生物材料，在抗多重耐药和促进药物吸收方面具有重要作用[12]。TPGS作为一种非离子表面活性剂，具有乳化药物、生物相容性和稳定的理化性质，因此TPGS可作为一种辅助稳定剂，使药物的性质更加稳定[13]。甲氨蝶呤与金-白蛋白纳米粒子结合后，使甲氨蝶呤的稳定性更好,对乳腺癌细胞的杀伤能力更强[14]。纳米脂质体搭载阿霉素后大大地降低了药物的心脏毒性，并且能提高阿霉素对肿瘤细胞的抑制作用[15]。PEG-DSPE搭载吉西他滨，增加了小鼠多种免疫细胞的数量，增强吉西他滨治疗胆管癌的效果[16]。基于TPGS的抗肿瘤药物纳米制剂具有更好的抗肿瘤效果，循环时间长以及生物利用度高，设计了基于TPGS修饰的纳米胶束系统(PEG2000-DSPE-TPGS)，并联合NT21MP对乳腺癌的影响。所以本研究以纳米载体为切入点，使PEG2000-DSPE-TPGS搭载紫杉醇制成紫杉醇纳米胶束。通过比较紫杉醇、紫杉醇纳米胶束及其联合多肽NT21MP对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、周期等生物学活性的影响，并探讨紫杉醇纳米胶束及其联合多肽NT21MP对乳腺癌耐药细胞的作用机制。本研究结果表明，紫杉醇纳米胶束对乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡的抑制作用明显强于紫杉醇，紫杉醇纳米胶束联合多肽NT21MP后抑制作用进一步加强，且细胞存活率随着浓度的升高，抑制能力进一步增强。

此外，在本研究中，紫杉醇纳米胶束及其联合多肽NT21MP处理乳腺癌耐药细胞后，EMT相关蛋白E-cadherin表达上调，Vimentin、Slug表达下调，而紫杉醇纳米胶束联合多肽NT21MP的效果更加明显。本研究还发现，紫杉醇纳米胶束抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进凋亡蛋白Bax、caspase3的表达。紫杉醇纳米胶束联合多肽NT21MP效果更明显，同时对耐药蛋白P-gp、BCRP的作用也是如此。

综上所述，紫杉醇通过与TPGS-PEG2000-DSPE结合制成紫杉醇纳米胶束，可以改善紫杉醇药物原有的缺陷，提升药效。紫杉醇纳米胶束在体外可有效抑制乳腺癌耐药细胞的增殖、迁移、侵袭以及逆转耐药和EMT的作用，通过联合多肽NT21MP可以更有效地抑制乳腺癌耐药细胞的生物学活性以及逆转EMT和耐药。