益气活血药对心梗后心肌纤维化大鼠不同亚型血小板源性生长因子表达的影响

莫涵瑢 郭书文 陈曦 李芳赫 占天为 王惠 冯鹏飞 魏路路 刘云柯 魏梵域

心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)是心肌梗死(myocardial infarction, MI)后一重要病理过程。一方面，发生心肌梗死后的纤维化瘢痕可以帮助提高室壁硬度，防止心脏破裂；另一方面，由于心肌细胞再生修复能力有限，过度增生的瘢痕会使心室顺应性下降，影响心肌正常的舒缩功能，从而引发各种恶性结局。而纤维化的过程中有多种生长因子和神经体液介质的参与，其中血小板源性生长因子(platelet-derived growth factors, PDGF)是最能说明纤维化的介质之一，具有促进伤口愈合和纤维化的作用[1]，在心肌修复的增生阶段参与刺激肌成纤维细胞的转化和成纤维细胞的增殖[2]。PDGFs在发育过程中是间充质细胞的关键调节因子，包括A、B、C、D四个亚型，不同亚型的PDGFs具有不同的作用，在某些情况下甚至是相反的作用[3]。本团队前期研究发现益气活血药可以有效减轻心肌纤维化，从而保护心脏功能[4]，但对PDGFs不同亚型的影响尚不清晰。因此，本研究进一步观察益气活血药对MI后MF大鼠不同亚型血小板源性生长因子的影响，为探究益气活血药治疗MI后MF的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康雄性SD大鼠(SPF级)60只，体重为(220±20)g，购自维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证：SCXK(京)2016-0006。在北京中医药大学SPF级实验动物房饲养。

1.2 主要药物与试剂

益气活血药由生晒参10 g、黄芪30 g、当归15 g、川芎15 g、三七粉6 g组成(该药物已申请专利，专利申请号为 201610368030.7)，中药由北京中医药大学国医堂门诊部药房统一购入，并于北京中日友好医院药剂科根据口服剂制备工艺水煎过滤浓缩，调整浓度为每1 mL相当于生药0.82 g，灭菌分装至100 mL医用玻璃瓶中备用；培哚普利叔丁胺片(雅施达)，规格：4 mg/片，使用前研磨溶于蒸馏水；注射用青霉素钠，南京海辰药业有限公司成产，规格：80万U；氯化钠注射液，华润双鹤药业，规格：500 mL/瓶。检测用抗体：胶原纤维(collagen)Ⅰ、collagenⅢ、PGDF-B、PDGF-D(Abcam，ab34710、ab7778、ab178409、ab181845)，PGDF-A、PGDF-C(Thermo Fisher，PA5-99405、PA5-45229)，GAPDH(Immunoway，YM3029)，辣根酶标记的山羊抗兔IgG(SH-0031)，辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG(SH-0011)购于北京鼎国生物有限公司。

1.3 主要仪器

成都泰盟软件有限公司小动物呼吸机(型号：HW-101E)，迷你双垂直电泳槽(DYCZ-24DN型)，迷你转印电泳槽(DYCZ-40D型)，电泳仪(DG-300C)，酶标仪(ZS-3板式酶标仪)。

1.4 动物模型的制备

健康雄性SD大鼠进行适应性饲养3天后，采用经典心肌梗死动物模型制备方法[5]，1%戊巴比妥钠(4.2 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，背位固定后于左前胸上至锁骨下至腹部处备皮，行气管插管，连接小动物呼吸机进行人工呼吸(呼吸频率：80 次/分，呼吸比：1∶2，潮气量：6 mL)。消毒后于左肋3～4肋间隙处破皮，钝性分离肌层，暴露打开胸腔，剥离心包膜，以小棉球轻按压肺，暴露左冠状动脉前降支，结扎点位于左心耳与肺动脉圆锥间下2 mm处，用5/0无菌带线缝合针结扎后可观察到心脏变白，取出棉球，将心脏复位关胸，脱离人工呼吸机，待大鼠呼吸平稳后进行肌肉和皮肤缝合。术后连续3 天给予腹腔注射青霉素钠20 万单位/天以预防感染。假手术组以上文方法开胸暴露心脏后，只在左冠脉前降支处穿线不结扎，余步骤相同。

1.5 动物分组与给药

术后第二天对存活大鼠行术后心电图(ECG)，以Ⅰ、avL、V1-V6导联病理性Q波数量≥5个为造模成功的标准[6]，剔除不满足成模标准以及无MI表现的动物模型后，将成模动物随机分入模型组、培哚普利组、益气活血组，另设假手术组做对照，每组9只。术后第二天根据动物分组开始灌胃给药，每日1次。给药剂量根据人和大鼠等效剂量换算(折算系数W=6)进行计算，培哚普利根据临床常用最大剂量计算(0.4 mg/kg)，益气活血药根据前期研究经验[7]计算(8.2 g/kg)后进行灌胃。连续治疗28天后进行指标检测。

1.6 检测方法

1.6.1 大鼠心肌取材方法 以1%戊巴比妥那(3.2 mL/kg)的麻醉量麻醉大鼠，腹主动脉取血后摘取大鼠心脏，于4 ℃生理盐水中泵出心内多余血液，冰上取大鼠左心室梗死边缘区心肌组织，放入4 %多聚甲醛固定标本，冻存管取WB组织于液氮中冰冻保存。

1.6.2 超声心动检测 取材前1天以1 %戊巴比妥那(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，胸前区备皮后，将大鼠背位固定于超声工作台上，待大鼠心率平稳后，采用高频探头RMV716进行定位，通过M型曲线分析评价心脏功能，每组采集连续3个心动周期计算平均值。分别测量记录大鼠心脏左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)，左室短轴率(left ventricular fraction shortened，LVFS)，左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)，左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)数值并统计。

1.6.3 Masson染色 心肌组织石蜡切片进行马松染色，按照说明书进行操作。每个样本在显微镜镜下(×200 倍)观察，随机取5个不重叠的梗死边缘区视野，采用ImageJ软件进行图像分析，测算心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)。CVF=胶原面积/(胶原面积﹢心肌面积)×100 %。

1.6.4 Western-Blot 采用WB检测大鼠梗死心肌边缘区collagenⅠ、collagenⅢ、PDGF-A 、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D的蛋白表达。将组织按照10 %加入RIPA裂解液进行匀浆，提取蛋白样本-80 ℃保存备用。制胶上样后进行电泳，转膜(PVDF膜，恒压80 V转移3 小时)，室温摇床封闭1小时，根据抗体说明书加入适当比例稀释的一抗：collagenⅠ和collagenⅢ(1∶2000)，PDGF-A和PDGF-C(1∶1000)，PDGF-B和PDGF-D(1∶4000)，4 ℃孵育过夜。TBST摇床洗膜3次，每次5分钟，加二抗孵育2 小时后(1∶5000)，再次TBST摇床洗膜3次，每次5分钟。曝光时根据肉眼观察荧光强弱调整曝光时间(1～5分钟)，通过多次曝光以到达最佳效果，显影(约1分钟)，定影(5～10分钟)。胶片扫描后，图像采用Image J软件对目标条带进行图像分析，各组分别与内参GAPDH进行比较得出结果。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠心脏功能超声结果比较

与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS均显著降低(P<0.01)，而LVIDs、LVIDd显著升高(P<0.01)；与模型组比较，培哚普利组和益气活血药组LVEF、LVFS显著升高(P<0.01)，LVIDs、LVIDd则显著降低(P<0.01)。结果见表1。

表1 心梗28天各组大鼠超声数据结果

2.2 各组大鼠马松染色结果比较

假手术组心肌细胞呈红染，大小正常，排列整齐，结构清晰，间质呈蓝染，可见少量胶原纤维；模型组心肌细胞结构紊乱且间隙变宽，红染较黯，部分心肌细胞肥大，梗死区域可见广泛胶原纤维蓝染，弥漫性分布，间质大量纤维束将心肌细胞分隔呈条形或小岛状，大血管周围可见较多胶原纤维染色存在；两用药组病理改变较模型组均有所减轻，梗死区蓝染面积较模型组减小。

用Image J图像分析系统计算各组大鼠CVF后，结果显示心梗28天后，与假手术组的CVF(5.46±1.19)% 相比，模型组大鼠CVF(72.88±10.58)%显著升高(P<0.01)，培哚普利组和益气活血组大鼠CVF[分别为(47.72±9.53)%和(34.98±14.65)%]较模型组显著下降(P<0.01)。结果见图1。

注：A假手术组；B模型组；C培哚普利组；D益气活血组。

2.3 各组大鼠心肌组织collagenⅠ、collagenⅢ、Ⅰ/Ⅲ型胶原比值表达比较

与假手术组比较，模型组大鼠collagenⅠ蛋白表达以及Ⅰ/Ⅲ型胶原比值升高(P<0.05)，collagenⅢ蛋白表达呈降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，两用药组的collagenⅠ蛋白表达和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值下降，接近假手术组，其中益气活血组的差异具有统计学意义(P<0.01)，两用药组collagenⅢ的蛋白表达则较模型组显著上升(P<0.01)。结果见图2、表2。

注：A假手术组；B模型组；C培哚普利组；D益气活血组。

2.4 各组大鼠心肌组织PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D蛋白表达比较

与假手术相比，模型组大鼠PDGF-A和PDGF-C的蛋白表达显著下降(P<0.01)，PDGF-B显著上升(P<0.01)，PDGF-D未见明显差异(P>0.05)。与模型组相比，两用药组大鼠PDGF-A和PDGF-C的蛋白表达均有上升，其中益气活血组PDGF-A的表达升高具有统计学意义(P<0.05)，而培哚普利组和益气活血组大鼠PDGF-B蛋白表达均有下降(P<0.05，P<0.01)，PDGF-D未见明显差异(P>0.05)。结果见图3、表3。

注：A假手术组；B模型组；C培哚普利组；D益气活血组。

表2 心梗28 天各组大鼠心肌collagenⅠ、collagenⅢ蛋白表达和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值结果M(P25-P75)

表3 心梗28 天各组大鼠PDGFs蛋白表达结果M(P25-P75)

3 讨论

本课题所使用益气活血药为导师临床经验用方，中医理论认为“心主血脉”“气为血帅”，气助血行，若心气不足则无力推送血液于脉内流动，血脉痹阻，不通则痛，从而引起一系列以气虚血瘀证为主的临床表现，故益气活血疗法在有相关表现的心系疾病中具有广泛的应用。益气活血药从当归补血汤划裁而来，方中使用生晒参和大剂量黄芪，二者共奏益气之本，配伍以当归、川芎、三七粉活血止痛，通补兼施，意在“补而不壅滞，通而不伤正”。多年来在治疗心梗疾病的过程中取得了比较满意的临床疗效，故选用此方对心肌梗死后心肌纤维化大鼠PDGFs的影响进行研究。

当心肌梗死发生后，经过一系列复杂的病理反应，胶原纤维在心肌组织中沉积，其中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白是心脏细胞外基质(extracellular Matrix ，ECM)的主要成分。在正常的发育过程中，两者的比例应呈协调表达，组织成网，以维持正常的心肌结构和舒缩功能[8]。但在纤维化心肌中，胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比例失调，collagenⅠ蛋白表达上调，马松染色胶原蓝染区域增大，CVF也显著上升，均提示心肌梗死后的胶原过度沉积现象以及心肌纤维化的形成。另外，发现了collagenⅢ在模型组中表达下降，而在两用药组中上升的情况。考虑是由于心肌受损严重，在创面愈合和瘢痕形成的过程中，呈现collagenⅠ上升的趋势，而collagenⅢ显示出减少的迹象[9]。

PDGF是一种可以有效促进成纤维细胞和其他间充质细胞分裂，并具有趋化作用的生长因子。其由PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D四个成员组成。在心脏纤维化的过程中，成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化是关键标志，而PDGFs则是这个过程中的重要介质[1]。Ma等[10]也在醋酸脱氧皮质酮/盐(DOCA/salt)诱导的高血压大鼠模型中，通过使用PDGFs通路抑制剂伊马替尼成功抑制了纤维化的发生。尽管一般认为，同工型的生长因子对细胞的作用也应大致相同，但也有证据表明同工型的生长因子在疾病发展过程中也可能发挥着不同的活性功能[11]。

在正常心肌组织中，PDGFs的4位成员均有表达。其中PDGF-A和PDGF-C的蛋白表达在模型组中呈下降趋势，而两者在用药组中升高，考虑PDGF-A和PDGF-C在心梗过程中是起保护心脏作用的因子。Zhao等[11]观察发现，增强的血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)与梗死心肌中的PDGF-A和PDGF-D共定位，并认为这说明了PDGF-A和PDGF-D以自分泌/旁分泌方式在心脏修复中发挥作用。这也与Zhao等人得出的结论相符合。益气活血药可通过刺激PDGF-A的上升一定程度上发挥保护心肌的作用。

而PDGF-B在国内外的研究中显示参与了心肌梗死后心肌纤维化的过程。Radiosa Gallini等[12]学者认为PDGF-B的过表达会导致局灶性的纤维化和中度心肌肥大。程志清等[13]也使用三七总皂苷降低了病毒性心肌炎小鼠模型慢性期PDGF-B的表达，从而抑制了心肌胶原的增生。因此，可以认为培哚普利和益气活血药都可以通过抑制PDGF-B的活性减少纤维化，且益气活血药的效果优于培哚普利。此外，肌成纤维细胞在正常心肌中不表达，但会在梗死心肌中聚集表达。抑制PDGFs通路虽然不会减少梗死心肌中肌成纤维细胞的数量，但在第4周可以显著降低未梗死心肌的CVF[14]。因此，猜想益气活血药可能是通过限制梗死边缘区健存心肌的纤维化而发挥保护心肌的作用。

PDGF-D的蛋白表达在心梗后28天的观察中，无论是模型组还是用药组均未呈现明显的变化趋势。针对这个实验结果，在今后的研究中可以使用免疫荧光技术追踪定位PDGF-D是否存在组织细胞中的位移，或通过增加观察的时间点和观察区域(如心肌梗死区、边缘区、健存区等)，从而进一步探究心肌梗死后心肌纤维化过程中PDGF-D的变化特点。

综上内容，心肌纤维化作为多种心系疾病的继发症状，其治疗药物仍主要通过沙坦类[15]、他汀类[16]等降压降脂药物缓解纤维化症状，西药在抗心肌纤维化方面并没有公认的药物。相较来看，益气活血药在减轻心肌纤维化方面具有一定优势，可能通过激活PDGF-A，并且主要抑制PDGF-B的活性进行抗纤维化，从而发挥保护心脏的作用。