基于UPLC-Q-TOF-MSE的百合化学成分分析

林美妤 袁志鹰 曾琪 何瑶 肖碧霞 李怡杰 杜琪 陈乃宏

〔摘要〕 目的 利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MSE）技术对百合的化学成分进行定性分析。方法 液相采用Acquity超高效液相色谱，Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速0.4 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL;质谱采用Xevo G2-XS型四级杆飞行时间质谱仪，电喷雾离子源正、负离子模式下采集数据。通过分析一级质谱精确相对分子质量和二级质谱裂解信息，结合对照品与文献报道进行鉴定和推测。结果 从百合中初步鉴定了33个化合物，23个酚酸类化合物，8个甾体皂苷类化合物，2个生物碱类化合物。其中（25R）-呋甾烷-5-烯-1β，3α，22α，26-四醇-3，26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-5α-呋甾烷-3β，20α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、（25R）-螺甾烷-5-烯-3β，17α-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-葡萄糖苷均首次在该植物中发现。结论 UPLC-Q-TOF/MSE技术能全面、快速地对百合化学成分进行分析，为其药效物质基础和质量控制的进一步阐明奠定了良好的基础。

〔关键词〕 百合;化学成分;UPLC-Q-TOF-MSE;酚酸;甾体皂苷;生物碱

〔中图分类号〕R284.1       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.08.011

〔Abstract〕 Objective To perform qualitative analysis of the chemical constituents of Lilium broumii by UPLC-Q-TOF-MSE. Methods Acquity ultra-high performance liquid chromatography was used. Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm） was used in the liquid phase. The mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% formic acid was used for gradient elution. The volume flow rate was 0.4 mL/min， column temperature was 35 ℃， and the sample volume was 10 μL. The Xevo G2-XS quadrupole time-of-flight mass spectrometer was used to collect data by positive and negative ionization modes with electro-spray ionization source. By analyzing the accurate relative molecular mass of the first-level mass spectrometer and the information of the second-level mass spectrometry cleavage， identification and speculation were performed combined with the reference substance and literature reports. Results Totally 33 compounds including 23 phenolic acids， 8 steroidal saponins and 2 alkaloids were initially identified from Lilium broumii. Among them， （25R）-furost-5-en-1β， 3α， 22α， 26-tetrol-3， 26-di-O-β-D-Gls， （25R）-26-O-β-D-Glc-5α-furost-3β， 22α， 26-triol-3-O-α-L-Rha-（1→2）-β-D-Gls and （25R）-spirost-5-ene-3β， 17α-diol-3-O-α-L-Rha-（1→2）-β-D-Gls were firstly discovered in Lilium broumii. Conclusion UPLC-Q-TOF/MSE can analyze the chemical components of Lilium broumii comprehensively and quickly. This study lays a good foundation for the further elucidation of the pharmacodynamic material basis and quality control of Lilium broumii.

〔Keywords〕 Lilium broumii; chemical constituents; UPLC-Q-TOF/MSE

百合（Lilii Bulbus）來源于百合科多年生草本植物卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）、百合（Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker）、细叶百合（Lilium pumilum DC.）3种的干燥肉质鳞茎[1]，是湖南省道地大宗药材品种之一。现代药理实验研究表明百合及其有效成分具有多种药理活性，包括止咳祛痰、镇静催眠、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗缺氧性应激损伤、抗抑郁、降血糖及抑菌作用等[2]。百合主要以甾体皂苷和酚酸甘油酯类化合物居多，此外还含有一些多糖类、生物碱、黄酮、氨基酸及其他烷烃等成分[3]。百合药理作用广泛，但具体药效成分仍不明确，药效物质基础未阐明。另外2015版《中华人民共和国药典》未列出含量测定的控制指标，不能综合全面评价其质量，一定程度上制约了百合的市场化发展，因此，研究百合化学成分对阐明其药效物质基础及质量控制具有重要意义。本研究采用UPLC-Q-TOF-MSE对百合化学成分进行全面和快速的分析，根据化学成分的质谱信息及与对照品、相关文献数据比对，鉴定其结构，为进一步研究百合化学成分及资源开发利用提供依据。

1 材料

1.1  主要仪器

Acquity超高效液相色谱仪、Xevo G2-XS型四级杆飞行时间质谱仪、数据采集与处理采用Mass lynx 4.1及UNIFI软件（美国Waters公司）;Mini-Q Intergral型纯水机（美国Millipore公司）;2K15型低温超速离心机（德国sigma公司）;AL104型电子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2  试药

色谱甲醇和乙腈购自美国Merck公司，甲酸购自德国CNW公司，以上均为质谱纯。对照品对羟基苯甲醛（批号：HA060208198）、对香豆酸（批号：HA062209198）购自宝鸡市盛世科技公司;绿原酸（批号：102414）、咖啡酸（批号：200335）、阿魏酸（批号：101053）购自江苏永健医药科技有限公司;王百合苷A（批号：0252-DT01）购自上海standard科技公司;王百合苷B（批号：18081001）、王百合苷C（批号：18082203）、王百合苷E（批号：18081303）均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%，亮氨酸-脑啡肽（批号：W07101402）购自Waters中国有限公司。百合（批号：20170901）购于湖南千金药材有限公司，经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江教授鉴定为百合科植物百合（Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker）的鳞茎。

2 方法

2.1  色谱条件

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱：0～2 min，3% A;2～6 min，3%～10% A;6～9 min，10%～15% A;9～12 min，15% A;12～16 min，15%～25% A;16～18 min，25%～30% A;18～22 min，30%～40% A;22～25 min，40%～80% A;25～27 min，80%～95% A;27～30 min，95% A;30～36 min，3% A;柱温35 ℃;流速0.4 mL/min;进样量10 μL。

2.2  质谱条件

电喷雾离子化源（ESI），正、负离子检测模式。质谱数据格式为Continuum，脱溶剂气温度为600 ℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压2.5 kV，离子源温度120 ℃，锥孔电压40 V，气帘气流速为50 L/h，扫描范围为m/z 100～1 200。低能量扫描时，碰撞能量transfer和trap电压分别为4 eV和6 eV。高能量扫描时，负离子模式下transfer和trap电压分别为10 eV和60～75 eV。用亮氨酸-脑啡肽为内标（Lock SprayTM）对质量轴实时校正，流速为5 μL/min。

2.3  样品配制

2.3.1  供试品溶液的配制  百合粉碎后过80目筛（4号），取粉末0.5 g，置于50 mL锥形瓶中，精密称定，加入50%甲醇20 mL，称重，记录重量，室温下静置1 h，超声提取40 min，50%甲醇补足失重，12 000 r/min，离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，置于进样小瓶中，待测。

2.3.2  对照品溶液的配制  分別精密称量各对照品，均配制成终浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液，根据质谱响应稀释到合适的浓度。

2.4  数据处理

通过查阅相关文献[4-6]，总结了百合属植物的化学成分，建立包括化合物名称、分子式、精确相对分子质量的百合化学成分数据库。通过分析一级质谱精确相对分子质量和二级质谱裂解信息，结合对照品与文献报道进行鉴定和推测。

3 结果

百合样品在正、负离子模式下的离子流图见图1。根据数据分析方法，共推测了33个化合物，其中包括23个酚酸类化合物，8个甾体皂苷类化合物，2个生物碱类化合物，鉴定结果见表1。

3.1  酚酸类

酚酸类成分在ESI负离子检测模式下均有很好的响应。共检测到5个单聚酚酸类化合物，分别为化合物1、2、4、7、12，通过与对照品以及文献[7-8]比对，分别鉴定为对羟基苯甲醛、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸。其中咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸在质谱负离子检测模式下分别给出准分子离子m/z 179.034 6、m/z 163.040 2、m/z 193.050 1，结构上均有羧基，且容易发生断裂失去CO2，分别形成m/z 135.044 5，119.049 9，149.059 1的碎片离子。

共检测到18个酚酸甘油酯类化合物，其中8个为酚酸甘油酯苷类。化合物5、8、14、15通过与对照品比对分别鉴定为王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B。酚酸甘油酯类的一级质谱有较高丰度的准分子离子峰，在二级质谱图中，易得到咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸结构的离子片段，所以通过分析这些离子片段能快速鉴别其他酚酸甘油酯类成分的结构。

化合物3负谱下的m/z 179.034 6和161.022 4是咖啡酸离子峰及其掉水峰，通过与文献[9]比对初步鉴定为王百合苷K。化合物6和9的m/z 163.040 2是对香豆酸离子峰，m/z 145.028 4、119.049 9分别为m/z 163.040 2掉一分子水和CO2的离子碎片峰，通过与文献[9]及保留时间比对分别初步鉴定为王百合苷H和王百合苷D。化合物16的m/z 399.128 6和381.116 1为掉乙酰基及再一分子水后的碎片峰，m/z 163.040 2是对香豆酸离子峰，通过与文献[10]初步鉴定为4-乙酰王百合苷D。化合物11的m/z 193.050 1是阿魏酸离子峰，通过与文献[11]比对初步鉴定为王百合苷F。

化合物17和18的m/z 337.089 9为m/z 499.147 0碎片掉一分子葡萄糖或果糖后的碎片峰，m/z 193.050 1是阿魏酸离子峰，糖的连接位置未能确定，通过与文献[12]比对初步鉴定为3，6'-O-二阿魏酰基蔗糖及其异构体。化合物27和28的m/z 193.050 1碎片峰是阿魏酸离子峰，m/z 163.037 6是对香豆酸离子峰，对香豆酸连接位置未能确定，通过与文献[13-14]比对分别初步鉴定为1-O-阿魏酰-2-O-对香豆酰甘油酯或1-O-阿魏酰-3-O-对香豆酰甘油酯。化合物29和30，有明显高的m/z 193.050 1阿魏酸离子峰，推测含两分子阿魏酸，而两分子阿魏酸连接位置未能确定，通过与文献[13，15]及保留时间比对初步鉴定分别为1，2-O-二阿魏酰甘油酯和1，3-O-二阿魏酰甘油酯。

3.2  甾体皂苷类

甾体皂苷类化合物在ESI负离子检测模式下，一般出现[M+HCOO]+、[M-H]+和部分糖基丢失的碎片信息，提供的结构信息不够充分。ESI正离子检测模式下，一般可获得[M+Na]+、[M+H]+和糖链连续断裂糖基的碎片以及苷元的裂解信息，因此将二者相互结合能很好的对甾体皂苷类化合物进行鉴定。m/z 271和253是判断甾体皂苷骨架的特征离子，另外苷元结构易产生特征性的144 Da中性碎片，结构类型不同特征离子及碎片稍有差异[16-17]，这些信息将有助于不同甾体结构类型的解析。从百合中共鉴定了8个甾体皂苷类化合物，包括3个呋甾烷型和5个螺甾烷型。

化合物19在负谱出现准分子离子峰817.424 1[M+HCOO]+，离子峰771.409 6[M-H]+，正谱准分子离子峰795.409 6[M+Na]+，正谱一级谱图中未见[M+H]+峰，可见强的[M-H2O+H]+峰。呋甾烷醇型皂苷因C-22位羟基性质活泼易丢失，在正离子检测模式下多出现[M+Na]+和[M-H2O+H]+的信号，而不出现[M+H]+峰，螺甾烷醇型皂苷上有其它羟基取代时在正离子检测模式下会同时出现[M+H]+和[M-H2O+H]+峰，在季碳上有羟基时脱水峰会更为明显[18-19]。因未见[M+H]+峰将其推测为C-22位连有羟基的呋甾烷醇型皂苷。m/z 755.416 8、593.366 4分别为化合物19脱一分子水及一分子葡萄糖的碎片峰，m/z 449.254 8、431.314 5分别为m/z 593.37中性丢失144 Da和一分子葡萄糖的碎片峰，再分别继续断裂一分子葡萄糖和中性丢失144 Da后得到m/z 287.201 9片段，推测苷元部分有羟基取代，m/z 269.192 4、251.178 6为继续脱水的碎片峰。通过参照文献[20]初步鉴定为（25R）-呋甾烷-5-烯-1β，3α，22α，26-四醇-3，26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或其同分异构体，裂解途径见图2。

另两个呋喃型甾体化合物为24和25。化合物24在负谱出现准分子离子峰947.492 7[M+HCOO]+，离子峰901.482 8[M-H]+，正谱准分子离子峰m/z 925.475 5[M+Na]+，正谱一级谱图中未见[M+H]+峰，可见强的[M-H2O+H]+峰，二级质谱中m/z 723.427 7为化合物掉一分子水及一分子葡萄糖后的碎片峰，m/z 579.316 0为m/z 723.427 7中性丢失C8H16O2后的碎片峰，m/z 415.318 5为m/z 723.427 7掉一分子葡萄糖和一分子鼠李糖的碎片峰，m/z 271.203 6是接着中性丢失C8H16O2后的碎片峰，通过参照文献[21]初步鉴定为（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-呋甾烷-5-烯-3β，20α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷。化合物25在负谱出现准分子离子峰949.498 7[M+HCOO]+，离子峰903.494 8[M-H]+，正谱一级谱图中未见[M+H]+峰，可见强的[M-H2O+H]+峰，二级质谱图中所有碎片离子峰均比化合物24多2 Da，推测为母核上5，6位没有双键，通过参考文献[22]初步鉴定为（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-5α-呋甾烷-3β，20α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物22在负谱出现准分子离子峰945.482 7[M+HCOO]+，离子峰899.460 8[M-H]+，正谱准分子离子峰m/z 923.459 9[M+Na]+，正谱一级谱图中有[M-H2O+H]+峰及较弱的[M+H]+，二级谱中有m/z 287.201 9，269.192 4，251.181 9碎片信息，推测苷元部分有羟基取代[23]。通过参照文献[18，24]初步鉴定为（25R）-螺甾烷-5-烯-3β，12α-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→4）]-β-D-吡喃葡萄糖苷或重楼皂苷D。化合物23在负谱出现准分子离子峰947.492 7[M+HCOO]+，离子峰901.476 6[M-H]+，正谱准分子离子峰m/z 925.477 3[M+Na]+，正谱一级谱图中有[M-H2O+H]+峰及较弱的[M+H]+，二级质谱图中所有碎片峰均比化合物22多2 Da，推测为母核上5，6位没有双键，通过参照文献[24]初步鉴定为（25R）-5α-螺甾烷-3β，12α-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→4）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物31在负谱出现准分子离子峰929.473 3[M+HCOO]+，离子峰883.470 0[M-H]+，正谱出现准分子离子峰m/z 907.466 7[M+Na]+，正谱一级谱图中未见[M-H2O+H]+峰。化合物33在负谱出现准分子离子峰959.483 4[M+HCOO]+，离子峰913.482 9[M-H]+，正谱准分子离子峰m/z 937.477 3[M+Na]+，正谱一级谱图中有[M-OCH3+H]+及[M+H]+峰，化合物33比31多一个OCH3，二级谱图显示两者碎片峰裂解规律相似，通过与自建数据库比对分別初步鉴定为（25R）-螺甾烷-5-烯-3-β-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷和（25R， 26R）-26-甲氧基螺甾烷-5-烯-3-β-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

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（本文编辑  苏  维）