国兰的组织培养技术

符红艳 李卫东

兰花是我国的十大传统名花之一，在我国有两千多年的栽培历史。兰花以它特有的叶、花、香独具四清（气清、色清、神清、韵清），具有高洁、清雅的特点。兰科植物多数生长在温暖、湿润、通风、排水良好、有散射阳光的环境。中国是兰属分布中心之一，已知的兰属植物有31种，占全球兰属的一半以上，以地生兰为主。国兰是兰属中观赏价值较高的地生兰，其品种十分丰富，多达上千种，包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰等。

在20世纪以前，中国兰花主要是靠无性繁殖和到原产地采集野生种植物来供应市场。目前我国产兰山区的兰花资源受到很大破坏，容易到达的地方兰花基本绝迹，只有在人迹罕到之处的深山才有零星分布。兰花的繁殖可分为无性繁殖和有性繁殖两类。无性繁殖又称营养繁殖，包括分株繁殖、扦插繁殖等传统的繁殖方法，其特点是繁殖速度慢，周期长，很难实现快速繁殖，不能满足兰花实际生产的需要。有性繁殖又称种子繁殖，兰花的种子非常细小，呈粉末状，每个蒴果中常有数万粒甚至几百万粒的种子，种胚通常发育不完全，没有胚乳，只有一个弱小的胚，胚內含有很少的营养物质，绝大部分为脂类物质，外面覆盖一层不透水不透气的膜状物质，在自然条件下萌发率极低。兰花种子以随采收随播种为好。兰花种子的播种繁殖可分为有菌播种法和无菌播种法两种。有菌播种法是指兰花种子在自然环境中与兰菌共生也称共生萌发。真菌能促进种子的萌发，是由于菌丝为种子内的胚和基质构建了一个通道，菌丝吸收营养输送给种子，促进了种子的糖异生及营养物质的积累。无菌播种法是利用组织培养的方法，为兰花种子提供所需要的营养和适宜的环境，促使其萌发的一种方法。大部分兰花种子可通过无菌萌发方式发芽，在特定培养基上种子萌发生长。

兰花的组织培养始于20世纪60年代。1960年， 法国人莫雷尔就利用大花蕙兰的茎尖，将其分生组织诱导形成原球茎并分化成植株，为实现兰花生产的工厂化奠定了基础。我国在兰花组织培养方面起步较晚，但发展快，不少研究者都有研究组织培养，取得了很多成果。目前常用组织培养方法批量生产小苗，特别是热带兰花的组织培养快速繁殖比较成功。植物组织培养技术的应用和推广对其快速繁殖、品种复壮、加快优良品种的培育、挽救珍稀濒危种类等方面起到了重要作用，对国兰的快速繁殖和资源保存均具有重要意义。下面介绍一下国兰的组织培养技术：

外植体的处理。一般而言，凡是生长健壮、具有活性的细胞组织都可以作为外植体。兰花的茎尖、根尖、侧芽、花器官、种子等均可作为组织培养的外植体，其中新芽的茎尖是细胞分裂最旺盛、活性最强的部位，新芽和种子是利用最多的器官。将兰株上的新芽从基部切下剥去外面的1～2层叶片，用纱布包好后置于流水下加洗洁精冲洗30分钟，在超净台中用75%浓度酒精处理2分钟，无菌水冲洗3次，0.1%升汞或1%的次氯酸钠溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次，在无菌滤纸层上剥去外层叶片，将基部伤口重新切去一点，将剥好的4～6毫米茎尖接入培养基，基部稍按于培养基中。种子为外植体时，选择刚成熟的未开裂的蒴果，将果实置于流水下加洗洁精冲洗30分钟，然后在超净台中取75%浓度酒精处理3～5分钟，接着用1%的次氯酸钠溶液消毒20分钟，无菌水冲洗3～5遍，最后用无菌纸将其表面水分吸干。用解剖刀将果荚纵向剖开，取出种子后将其均匀撒播在培养基上。

原球茎的诱导和增殖。原球茎是指兰花种子形成的一种具有再生能力的小球状体，而通过兰花植物其他部位形成的类似于原球茎的球状体称为类原球茎。萌发培养基可采用MS培养基+奈乙酸1.0 mg/L+6-苄氨基嘌呤 1.0 mg/L+胰蛋白胨 2.0 g/L +活性炭2.0 g/L，接种后在26℃，弱光或暗光下培养。3～8个月开始萌发，先萌发形成原假鳞茎。当种子萌发形成的原假鳞茎伸长超过1厘米时，其上常有多个小原假鳞茎，将原假鳞茎从分支处掰开，移植到增殖培养基上培养。国兰的增殖培养基以MS基本培养基+奈乙酸0.5 mg/L +6-苄氨基嘌呤 1.0 mg/L+胰蛋白胨 2.0 g/L +活性炭3.0 g/L为好，对原假鳞茎生长效果好，一般都可以大量增殖。

分化培养。当增殖达到一定的量时进行分化培养，将粗壮的根状茎切割成1厘米的小段转入到分化培养基上，每瓶10个左右，以MS为基本培养基，添加奈乙酸 0.1～0.5 mg/L、6-苄氨基嘌呤 2.0～3.0 mg/L、胰蛋白胨 2.0 g/L和活性炭2.0 g/L。接种后在26℃的光照培养下。约经过1个月其顶端便开始芽的分化，随后长成瘦小的幼芽，呈绿色，幼芽伸长继而分化出2片幼叶，有些原假鳞茎基部长出白色突起。

壮苗与生根。兰花组培苗本身的生命力强弱对移栽能否成活有很大的影响。凡生命力强，小苗健壮，有较发达根系的易于移栽和成活;反之，则不易移栽或移栽后成活率较低。当幼苗高3～4厘米时转入壮苗生根培养基，让芽、叶与根按比例生长。生根培养基采用MS培养基+奈乙酸 2.0～3.0 mg/L +活性炭3.0 g/L。在生根培养基上约20天即可生根。

驯化与移栽。当每株幼苗有3～5条发育较好的肉质根时，可将幼苗移出培养瓶，栽植到盆中。小苗从培养瓶中取出后用水洗去根部的培养基。用切碎的苔藓、泥炭、碎木炭和少量沙配成栽培基质，将小苗栽在小盆中。而后放在25℃左右的温室中，保持较高的空气湿度和较强的散射光。每周施1次液体肥料，并喷洒抗菌剂，1个月后可移植到光线较强的地方，随植株长大及时换盆。