Crybb2基因敲除对小鼠晶状体自噬的影响

高 谦，李建翠，段玉萍，袁想妹，厉 倩

0引言

白内障是人类第一位致盲眼病，占所有失明疾病的47.8%。据估计，到2025年全球白内障失明人数将达到4000万[1]。诸多因素如老化、眼损伤、糖尿病、紫外线照射及某些药物使用等均可导致白内障的发生[2-3]，其中老化所引起的年龄相关性白内障占绝大部分。白内障的主要特征是晶状体混浊，晶状体主要由α、β、γ三类晶状体蛋白组成，三类晶状体蛋白对维持晶状体的透光性具有重要的作用。β晶状体蛋白在年轻人晶状体蛋白中比例约占40%，并随着年龄增长因其晶状体修饰变化较大，老年人晶状体内不溶性蛋白比例升高，可能对年龄相关性白内障产生具有重要影响[4]。beta-B2晶状体蛋白(CRYBB2)是β晶状体蛋白的一种亚组分，与白内障的发生发展关系极为密切，其基因突变或敲除可以导致白内障产生[5-6]，但对于晶状体透明性维持确切作用尚不清楚。

自噬是机体一种依赖于溶酶体水解酶和酸性脂肪酶的吞噬自身细胞组分(如蛋白质聚集体、脂质、细胞器)并对其进行降解的过程。自噬通过去除毒性蛋白质聚集物和损伤的细胞器保护细胞，而年龄相关性白内障的发生发展恰恰与变性的晶状体蛋白聚集、损伤纤维细胞、破坏晶状体的结构密切相关。然而，自噬识别和降解错误折叠或聚集蛋白质的确切机制尚未阐明。近年研究发现，自噬与白内障形成关系密切[7-9]，是一种新发现的重要致病途径。自噬参与晶状体细胞器退化[10]及蛋白质降解过程，晶状体细胞自噬中断造成细胞器和异常蛋白降解缺陷，晶状体蛋白基因突变或缺失会影响细胞自噬功能，导致白内障产生。

本课题组于2006年与国外合作单位共同构建、顺利饲养繁殖Crybb2基因敲除(Crybb2KO)小鼠，并进行CRYBB2功能的相关研究，发现Crybb2KO小鼠在出生6～8周龄时在皮质后部观察到点状白内障，4mo时更明显，6mo时开始出现点状皮质白内障，主要部位在后皮层和前皮层，白内障严重程度随年龄增长而加重；18mo时整个晶状体完全混浊；Crybb2KO小鼠晶状体重量和轴向直径明显小于野生型(WT)小鼠；扫描电镜显示6月龄Crybb2KO小鼠晶状体纤维细胞排列不规则，并有突起；WT小鼠晶状体纤维呈放射状排列，排列规则；透射电镜显示Crybb2KO小鼠晶状体细胞发生扭曲变形，而WT小鼠晶状体细胞形态规则[5]。通过对CRYBB2、自噬与白内障发病机制的研究，对于白内障的预防和治疗有重要的作用，可为防治白内障提供新的思路和理论依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物实验组小鼠为Crybb2KO小鼠，由美国iGTL(in Genious Targeting Laboratory)实验室赠送，并成功在国内进行繁殖[5]。对照组小鼠为野生型C57BL/C小鼠，购自第二军医大学实验动物中心。所有小鼠在无病原体的小鼠室中维持12h光照/12h黑暗循环，随意自由获取食物和水喂养。本研究涉及的全部方法均符合动物伦理委员会的要求，同时获得了上海市第一人民医院动物伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂和仪器兔LC3B多克隆抗体(NB600-1384C，美国Novus Biologicals公司)；兔P62单克隆抗体(abl09012，英国Abcam公司)；兔雷帕霉素靶蛋白(mTOR)多克隆抗体(2983S，美国CST公司)；兔p-mTOR多克隆抗体(5536S，美国CST公司)；兔GAPDH多克隆抗体(ab9485，英国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(ZB-2301，北京中杉金桥公司)；JEM1230透射电子显微镜(日本电子Jeol公司)。

1.2方法

1.2.1透射电子显微镜下观察晶状体自噬情况分别用6月龄WT和Crybb2KO小鼠各3只，取双眼晶状体组织，切取皮质层及核心区分别放入4%戊二醛溶液中固定24h。采用磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)冲洗1%锇酸后固定，用乙醇梯度脱水，100%丙酮浸透，环氧树脂包埋、制片。将铺于铜网上的切片经枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色后，用透射电子显微镜观察两组小鼠晶状体皮质区和核区细胞器退化情况及自噬小体数量。

图1 透射电子显微镜检查(×10000) A：WT小鼠，晶状体核区线粒体完全退化；B：Crybb2KO小鼠，晶状体核区存在未完全退化线粒体(黑色箭头)。

1.2.2 Western blot法检测晶状体自噬相关蛋白的表达分别取6月龄WT和Crybb2KO小鼠各3只，双眼晶状体组织放入含有蛋白酶抑制剂的蛋白抽提试剂中研磨匀浆后转移至离心管中，4℃、12000r/min离心20min。取上清，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，加入加样缓冲液变性；SDS-PAGE蛋白电泳；通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉封闭，TBST洗3次；5% BSA稀释一抗(LC3B、P62、mTOR、p-mTOR、GAPDH，1∶2000)，孵育后洗涤；5% BSA稀释二抗(1∶10000)，孵育后洗涤，Odyssey扫描成像。ECL化学发光液显影成像，暗室压片洗片。采用Image J图像分析软件分析LC3B、P62、mTOR、p-mTOR表达的灰度值，以GAPDH为内参照，计算各目的蛋白相对表达量。实验至少重复3次，取平均值。

图2 小鼠晶状体P62和LC3B表达变化 A：Western blot法检测小鼠晶状体P62的表达；B：Crybb2KO和WT小鼠晶状体P62表达水平比较；C：Western blot法检测小鼠晶状体LC3B的表达；D：Crybb2KO和WT小鼠晶状体LC3B表达水平比较。aP<0.05 vs WT。

2结果

2.1小鼠晶状体线粒体形态变化透射电子显微镜下观察发现，Crybb2KO小鼠晶状体核区存在未完全退化的线粒体，线粒体嵴部分断裂(图1)。

2.2小鼠晶状体细胞自噬情况6月龄WT小鼠晶状体皮质区自噬小体数量(11.0±0.86AVs/100μm2)少于Crybb2KO小鼠(20.0±2.16AVs/100μm2)，差异有统计学意义(t=-6.705，P<0.01)。

2.3小鼠晶状体P62和LC3B表达变化Crybb2KO小鼠晶状体组织中P62的表达(0.64±0.09)显著高于WT小鼠(0.43±0.07)，LC3B的表达(0.09±0.01)则显著低于WT小鼠(0.26±0.05)，差异均有统计学意义(t=3.1905、-5.774，均P<0.05，图2)，表明Crybb2KO小鼠晶状体细胞自噬明显减弱，P62等蛋白出现集聚，提示CRYBB2晶状体蛋白缺失很可能会影响晶状体自噬，从而导致白内障发生。

图3 小鼠晶状体mTOR和p-mTOR表达变化 A：Western blot法检测小鼠晶状体mTOR和p-mTOR的表达；B：Crybb2KO和WT小鼠晶状体mTOR和p-mTOR表达水平比较，bP<0.01 vs WT。

2.4小鼠晶状体mTOR和p-mTOR表达变化采用Western blot法检测小鼠晶状体组织mTOR信号通路的活化，发现Crybb2KO小鼠晶状体组织中p-mTOR的表达(0.41±0.03)高于WT小鼠(0.27±0.02)，差异有统计学意义(t=5.774，P<0.01)，mTOR表达无差异(图3)。提示Crybb2KO小鼠晶状体组织中mTOR存在活化，可能参与了Crybb2KO小鼠晶状体自噬的抑制。

3讨论

晶状体蛋白占晶状体水溶性蛋白的90%，是晶状体的主要组成部分，在维持晶状体透明度中起关键作用。目前研究发现，晶状体蛋白缺失或突变会影响细胞的自噬功能，使不溶性蛋白的清除受阻，从而导致白内障发生[11-13]。aB-R120G和 aA-R49C突变纯合子小鼠晶状体自噬受到抑制，引起晶状体内异常蛋白的降解障碍而集聚，导致遗传性白内障的形成[11-12]。βA3基因敲除小鼠会产生先天性核性白内障，其晶状体自噬过程被阻断；该小鼠的晶状体出现溶酶体清除缺陷，异常蛋白在外皮质区域细胞核和线粒体积聚，自噬小体增多而积聚；同时，该小鼠晶状体细胞内Ca2+水平和钙蛋白酶-3的表达和活性均增加。表明晶状体因缺少βA3晶状体蛋白或该蛋白的相应功能，改变了钙的稳态，从而导致细胞内溶酶体功能受损和钙蛋白酶活化。这些缺陷正是导致βA3基因敲除鼠晶状体发生核性白内障的主要原因[13]。

Crybb2基因突变易导致先天性白内障，突变通常发生在外显子6上。突变可使表达的晶状体蛋白折叠发生改变，从而造成晶状体结构异常，并减弱了其在水溶状态下的稳定性，进而引起晶状体透明性改变，最终导致先天性白内障的发生[14-15]。CRYBB2蛋白缺失会引起皮质性白内障，本研究对6月龄WT和Crybb2KO小鼠晶状体进行自噬相关研究，透射电子显微镜结果显示Crybb2KO小鼠晶状体自噬明显减弱，其晶状体皮质区自噬小体明显多于WT小鼠。自噬在晶状体纤维细胞成熟，构成无细胞器区(organell-free zone，OFZ)的过程中起着重要作用。自噬通过降解受损蛋白质和线粒体以及通过纤维细胞成熟过程中线粒体的清除来形成晶状体的OFZ区，对于维持晶状体稳态非常重要[16]，没有降解和回收累积的线粒体会影响晶状体的状态，Crybb2KO小鼠OFZ区存在未完全退化的线粒体结构，且线粒体累积明显，其自噬小体的数目增多可能与其破坏自噬流，增加自噬小体堆积有关。

自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ与PE结合转变为(自噬体)膜型(即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ对自噬体的形成是非常重要的，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低[13]。Sequestosome-1(SQSTM1)/P62可以被自噬特异性降解，反映蛋白质聚集体的积累和自噬激活程度，可以用做自噬被中断的标记[17]，一般用P62联合LC3指标进行自噬流的评估。本研究发现WT小鼠晶状体组织LC3B表达显著高于Crybb2KO小鼠，P62表达低于Crybb2KO小鼠，提示CRYBB2晶状体蛋白缺失很可能会影响晶状体自噬，晶状体细胞自噬的减弱或阻断使不溶性蛋白和细胞器的清除受到严重影响，最终导致白内障的发生发展。自噬过程受多种信号传导通路调控，可分为依赖于或独立于哺乳动物mTOR通路，mTOR是PI3K/Akt下游的一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可通过激活核糖体激酶，调控多种细胞的生物学功能；mTOR激活还可显著抑制自噬的激活[18]。本研究中，Crybb2KO小鼠晶状体组织p-mTOR表达显著高于WT小鼠，提示CRYBB2晶状体蛋白可能与mTOR信号通路调控自噬相关。

综上所述，CRYBB2晶状体蛋白缺失会影响晶状体自噬，其机制可能与mTOR信号通路调控自噬相关。本研究仅检测了Crybb2基因缺失后，小鼠晶状体组织自噬及其相关蛋白的改变，今后应进一步研究CRYBB2晶状体蛋白在自噬相关的mTOR信号通路的具体调控机制来明确白内障的发病机制，为白内障的防治提供理论基础。