2个多品系混杂转基因大豆样品检测初探

徐君怡， 杨莉莉， 罗 佳， 白景莲， 刘玥婷, 赵 宇， 郑秋月

(大连海关 技术中心，辽宁 大连 116001)

中国是大豆原产国，具有约5 000 a栽培历史[1].大豆不仅是人类主要的油料作物和植物性蛋白来源，而且是重要的工业原料，在粮食安全及国民经济中占有重要地位[2].

大豆种子中的蛋白质含量和油分含量占其干重的60%以上，其中,蛋白质含量高达40%以上[3].随着人们生活水平的提高，对大豆的需求日益增强，但是大豆是一种“土地密集型”产品，一年一熟.我国人多地少，在这类产品上不具有优势[4].与玉米、水稻等禾谷类作物相比，大豆绝对产量很低，如按能量转换计算，大豆产量只有玉米的1/3.加上大田除草等工作量大，导致大豆比较效益低，制约大豆种植.考虑到资源禀赋的原因，我国大豆主要依靠国外市场[5].中国大豆进口量占全球大豆贸易量的60%.据海关总署2020年1月14日发布数据，2019年12月中国大豆进口量为954.3万t，同比飙升67%.

从全球首例抗草甘膦转基因大豆诞生以来[6],很多转基因作物性状都批准上市, 包括抗除草剂性状、抗虫性状等.但是现代育种的发展对转基因作物性状的要求也越来越高,传统的单性状已经不能满足现代农业的要求,于是就诞生了聚合两种或者多种转基因性状的复合性状转基因作物.复合性状转基因作物是指含有2个或者多个转基因性状的转基因植株[7].目前，中国还没有建立复合性状转基因作物的评价体系.现批准的复合性状转基因作物完全按照单一性状转基因作物的审批流程进行, 在所有国家和地区中是最严格的.在检测技术上，与传统单一性状转基因技术相比，复合性状转基因作物的检测技术现在还不够成熟, 还没有一套完整的检测技术体系，无法实现对复合性状转基因作物的快速检测.另外,对复杂混合样品中复合性状转基因作物的定量还缺少系统深入的研究.

转基因作物种植面积持续增加，这可能有助于减轻全球饥饿和营养不良问题.但是为了确保转基因作物带来的效益不仅仅满足当前需求，还能够持续下去、符合未来利益，需要以科学为基础，采取谨慎的、前瞻性的监管措施，从环境保护和可持续发展的角度关注农业生产力[8].

根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)发布的数据显示[9]，在所有的商品化的转基因作物中，转基因大豆共有41个品系.其中，中国批准用于生产或用作加工原料的大豆品系17种.本文对大豆样品进行筛查检测过程中，发现了2个多品系混杂的大豆样品.为了进一步确认转基因大豆品系，采用实时荧光定性PCR方法进行转基因大豆品系特异性的筛查检测，对未批准进境或不符合生物安全证书的转基因品系进行排查.

1 材料与方法

大豆标准品来自欧洲标准物质ERM或美国标准物质AOCS，包括转基因大豆GTS-40-3-2(ERM-BF410dk、ERM-BF410ep)、DP356043(ERM-BF425d)、DP305423(ERM BF426d)、DAS68416-4(ERM-BF432d)、A5547-127(AOCS 0707-C3)、MON89788(AOCS 0906-B2)、A2704-12(AOCS 0707-B11)、MON87701(AOCS 0809-A)、CV127(AOCS 0911-D)、MON87705(AOCS 0210-A)、MON87769(AOCS 0809-B)、FG72(AOCS 0610-A4)、MON87708(AOCS 0311-A)、DAS-81419-2(ERM-BF437e)、DAS-44406-6(ERM-BF436e)、MON87751(AOCS 0215-A)，以及非转基因大豆(AOCS 0906-A、AOCS 0911-A).检测样品为实验室留存的大豆样品.

1.1 基因组核酸提取

实验材料放入液氮中研磨.采用TaKaRa公司的DNA extraction kit of genetically modified organism (GMO) detection Ver2.0 (No. D9093;TaKaRa,Dalian, China)试剂盒进行基因组DNA的提取.提取的基因组DNA溶于 100 μL Tris-EDTA (TE) 溶液中.纯化后的DNA样品用紫外分光光度计(ND-1000;NanoDrop,Wilmington, DE)测定浓度.

1.2 检测方法

采用转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法SN/T 1204—2016[10]中大豆品系特异性的引物探针进行定性检测.首先采用转基因大豆筛选检测基因pCaMV35S、pFMV35S、tNOS、BAR、PAT、GOX、CP4-EPSPE、CTP2-CP4-EPSPS、tE9进行转基因的筛选检测.对转基因大豆筛选检测基因阳性的样品，进行SYHTOH2、DP68416-4、FG72、GTS40-3-2、MON87751、DAS44406、DAS81419-2、MON87708、MON87769、MON87705、CV127、MON87701、DP305423、DP356043、A5547-127、MON89788、A2704-12等17种转基因大豆品系的筛查检测.

对于同时检出2个以上品系阳性的样品，采用单粒多靶点的检测方法进行复合品系的确认.即取1粒转基因大豆种子，按照1.1的方法进行基因组核酸的提取.然后采用SN/T 1204—2016的大豆品系特异性引物探针进行定性检测,检测的引物探针序列见表1.

为了尽可能地避免低浓度混杂造成的检测结果误差,对再次选取的1粒转基因大豆种子，采用先流水冲洗,然后在纯水中浸泡2 h的方法洗净杂质, 按照1.1的方法进行基因组核酸的提取.采用单粒多靶点的检测方法进行复合品系的确认.

表1 转基因大豆品系实时荧光PCR检测用引物和探针

表1(续)

2 结果与分析

2.1 大豆样品品系筛查检测

对2个转基因大豆筛选检测基因阳性样品，进行品系筛查检测，结果如表2所示.1号大豆样品检出了GTS40-3-2、MON87708、MON89788等3种转基因大豆品系；2号大豆样品检出了MON87708、MON89788、A2704-12等3种转基因大豆品系.扩增结果见图1和图2.阳性对照结果正常.

表2 2份大豆样品17个转基因大豆品系筛查检测结果

图1 1号大豆样品17种转基因大豆品系的筛查检测结果

图2 2号大豆样品17种转基因大豆品系的筛查检测结果

2.2 单粒种子样品品系筛查检测

对单粒种子进行检测时发现，有个别基因的扩增曲线信号很弱，Ct值也比较靠后.1号大豆单粒种子样品检出MON89788品系阳性，MON87708和GTS40-3-2品系弱阳性(35

2.3 单粒种子样品水洗浸泡后品系筛查检测

为了尽可能地避免低浓度混杂造成的检测结果误差,对再次选取的1粒转基因大豆种子，先流水冲洗,再在纯水中浸泡2 h的方法洗净杂质, 然后进行基因组核酸的提取.1号大豆单粒清洗种子样品检出MON89788品系阳性.2号大豆单粒清洗种子样品检出MON89788和MON87708品系阳性.由于是单粒种子DNA提取，2号大豆单粒清洗种子样品判断应该是MON89788×MON87708复合品系.扩增结果见图5和图6.阳性对照结果正常.

图3 1号大豆单粒种子17种转基因大豆品系的筛查检测结果

图4 2号大豆单粒种子17种转基因大豆品系的筛查检测结果

图5 1号大豆单粒清洗种子17种转基因大豆品系的筛查检测结果

图6 2号大豆单粒清洗种子17种转基因大豆品系的筛查检测结果

2.4 3次检测结果的比较

对于3次扩增结果Ct值的比较见表3.对于1号大豆样品，第1次检测用的是混合大豆样品进行基因组提取，因此阳性基因扩增信号都很强，Ct值也都<30个循环.第2次检测，用的是单粒种子样品，但是没有进行清洗，可能存在其他品系的低水平混杂现象.1号大豆单粒种子检出MON89788品系阳性，在第1次混合样品中检出的GTS40-3-2、MON87708品系也能够微弱检出(35

对于2号大豆样品，第1次检测用的是混合大豆样品进行基因组提取，阳性基因扩增信号都很强，Ct值也都<30个循环.第2次检测，用的是单粒种子样品，没有进行清洗，但因为是MON89788×MON87708复合品系，扩增信号依然很强，Ct值都<30个循环.第3次经过清洗的2号大豆单粒种子依然检出MON89788和MON87708品系阳性，验证了2号大豆单粒种子存在MON89788×MON87708复合品系的结论.由于取的是单粒种子，在第2次和第3次检测中都没有A2704-12品系的扩增信号.

根据3次的检测结果推断，1号大豆样品可能是GTS40-3-2、MON87708、MON89788等3种转基因大豆品系的混合物；2号大豆样品可能是MON89788×MON87708复合品系和A2704-12等2种转基因大豆品系的混合物.

对于复合性状转基因作物的检测是世界性的难题，应用较多的是单粒多重PCR法[11].这种方法将单粒的作物样品进行基因组提取, 用多重PCR对其DNA进行扩增,最后通过目的条带的条数和位置确定是否为复合性状转基因作物.近来，多重实时荧光PCR 技术已广泛应用于转基因检测领域[12-15]，也为复合性状的转基因品系筛查检测带来进展.但是对于复合性状的转基因作物检测目前还没有一套完整的检测技术体系.

根据国际农业生物技术应用服务组织发布的数据显示[9]，至今通过审核了41个转基因大豆品系，其中，复合性状转基因大豆16种(表4).MON87708×MON89788是孟山都公司的转基因供体的常规育种杂交与选择产生的复合品系.复合叠加的商业性状是除草剂抗性.目前，MON87708×MON89788品系仅在4个国家批准种植，分别为乌拉圭(2012)、哥伦比亚(2012)、日本(2014)和巴西(2017).批准进口作为饲料和加工原料的国家和地区有8个，分别为阿根廷(2018)、巴西(2010)、哥伦比亚(2012)、欧盟(2015)、日本(2014)、墨西哥(2013)、菲律宾(2017)和韩国(2012).中国批准用于生产或用作加工原料大豆品系17种，其中，包括A2704-12、A5547-127、CV127、DP305423、DP356043、GTS40-3-2、MON87701、MON87708、MON87769、MON89788、DAS-81419-2、DAS-DAS-44406-6-6、FG72、MON87705、SYHT0H2等15种单一性状品系和DP305423×GTS40-3-2、MON87701×MON89788等2种复合性状品系，而2号大豆样品检出的MON89788×MON87708复合品系是在中国未经批准的大豆品系.这一情况提醒我们，虽然单一品系的检测结果是符合生物安全证书批准清单要求的，但是存在恶意混杂不符合生物安全证书批准清单的复合性状品系的可能.随着转基因技术的推广以及商业化程度的加深，进口大豆或市售大豆制品所含转基因成分越来越复杂.大豆的进口贸易量在逐年增加，这一恶意行为不仅会对国内的生物安全造成极大的危害，对大豆的进口贸易也造成无法估量的损失.因此，国内的农业安全监管部门和海关检疫部门都应该引起高度的重视.

表3 3次扩增结果的Ct值比较

表4 复合性状转基因大豆品系汇总表