益气化痰活血方对AIT小鼠甲状腺Ets-1、IL-17基因表达的影响

侯敏,杨潇*,宋囡,王智民,曹慧敏,高天舒*

(1.辽宁中医药大学附属第二医院,辽宁 沈阳 110034;2.辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110032; 3.辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110032)

自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT),是内分泌系统常见的一类慢性、反复发作的自身免疫病，在我国地区发病率逐步上升[1]，是甲状腺功能减退、桥本脑病、妊娠期甲状腺功能异常、流产、产后甲状腺炎的关键因素，并能影响妇女后代智力发育，其影响全球大约10%人群。本课题组在前期临床研究中发现，中药复方具有很好的临床疗效[2]，前期动物实验进一步证实益气化痰活血方能有效减轻AIT小鼠甲状腺淋巴细胞的炎性浸润、明显减轻甲状腺炎程度、降低分泌炎症细胞因子IL-17的Th17细胞比例，具有改善AIT小鼠免疫失常作用[3-6]。Th17细胞通过分泌IL-17发挥主要生物学效应，而Ets-1则是Th17细胞分化的负调控因子，能抑制IL-17生成[7],本实验研究将从Ets-1角度探讨益气化痰活血方对AIT小鼠甲状腺炎症因子IL-17的影响，将部分揭示益气化痰活血方对于改善AIT小鼠免疫炎症的具体机理。

1 材料

1.1 动物

由美国杰克逊实验室引进NOD.H-2h4种鼠2雌2雄，辽宁中医药大学动物实验中心繁育到8周龄同批次小鼠，共60只，SPF级。

1.2 药物

中药饮片由辽宁中医药大学附属第二医院提供，处方为益气化痰活血方(红参 15 g，黄芪 30 g，当归10 g，莪术 10 g，法半夏 10 g，浙贝母 20 g，生牡蛎 15 g，鳖甲 10 g)，制备成生药量为2.0 g/mL水煎液；阳性对照药硒酵母片(牡丹江灵泰药业股份有限公司生产，批号：国药准字H10940161，规格：50 μg/片)，以去离子水溶化成浓度为1.625 μg/mL。

1.3 主要试剂

无水乙醇(中国国药)，三氯甲烷(中国国药)，Trizol试剂盒(TaKaRa公司)，SYBR Green Mater Mix试剂盒(康为世纪)，逆转录试剂盒(康为世纪)，引物委托TaKaPa公司设计合成，GADPH PR 5′-GTTCACACCGACCTTCACCA-3′；Ets-1(小鼠)PF 5′-CCAGTCATCCTTCAACAGCC-3′；Ets-1(小鼠)-PR 5′-AGCACGGTCACGCACATAGT-3′；IL-17(小鼠)-PF 5′-CCCTCAGACTACCTCAACCGTT-3′；IL-17(小鼠)-PR 5′-GCTTTCCCTCCGCATTGA-3′。

1.4 主要仪器

TriStar2 LB 942型多功能酶标仪(Berthold company)，SHZ-88型水浴恒温振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司)，Bio Spec-nano型紫外可见分光光度计(岛津，日本)，7500Real Time PCR仪(Applied Biosystems，美国)。

2 方法

2.1 分组

NOD.H-2h4小鼠随机分为6组：正常组(NG)，模型组(MG)，西药组(SeG)，益气化痰活血方高、中、低剂量组(YG-1、YG-2、YG-3)，每组10只，共60只。

2.2 造模

NG组不做处理，其余各组参照国际标准，自由饮用0.05%碘化钠水，8周后制成AIT动物模型，用于实验。

2.3 给药

造模成功后开始灌胃给药，按每千克体质量小鼠的给药量为人的9.1倍计算，各组小鼠每天灌胃量分别为YG-1：36.40 g/kg、YG-2：18.20 g/kg、YG-3：9.10 g/kg体质量。NG组、MG组灌服等量蒸馏水，SeG组灌服硒酵母混悬液，每日1次，灌胃8周后取材。

2.4 标本采集

甲状腺取材具体方法参照本课题组前期研究[3-6,8-9]。

2.5 小鼠甲状腺IL-17、Ets-1基因检测

Trizol处理各组小鼠甲状腺组织，提取总RNA，超微量紫外分光光度计测定260 nm及280 nm OD值，计算RNA的浓度和纯度，然后将RNA逆转录成cDNA，反应体系为20 μL，反应条件为37 ℃ 15 min，SYBR Green Mater Mix试剂检测IL-17、Ets-1基因的mRNA水平，85 ℃ 5 s，PCR循环条件为95 ℃ 0.5 min 1个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s 1个循环，每份标本均行复管检测3次。基因的相对表达量用公式2-ΔΔCt方法进行相对定量。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 对AIT小鼠甲状腺IL-17 mRNA表达的影响

AIT小鼠甲状腺IL-17 mRNA表达与NG组比较显著上调，差异有统计学意义(P<0.01)；SeM组、YG-1、YG-2、YG-3组IL-17 mRNA表达与MG组比较均下调，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1，表1。

注：与NG组比较，**P<0.01；与MG组比较，▲▲P<0.01图1 各组小鼠甲状腺组织 IL-17 mRNA表达

表1 各组小鼠甲状腺组织 IL-17及Ets-1 mRNA相对表达量比较

3.2 对AIT小鼠甲状腺Ets-1 mRNA表达的影响

AIT小鼠甲状腺Ets-1 mRNA表达与NG组比较显著下调，差异有统计学意义(P<0.01)；SeM组、YG-2、YG-3组 Ets-1 mRNA表达与MG组比较均上调，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2，表1。

注：与NG组比较，**P<0.01；与MG组比较，▲▲P<0.01图2 各组小鼠甲状腺组织Ets-1 mRNA表达

4 讨论

现代医学认为AIT的病因和病理机制与先天遗传因素、后天环境影响、凋亡、免疫炎症等多方面相关[10]，其中以分泌IL-17发挥主要生物学效应的Th17细胞是AIT发病的机制之一已被证实，我们前期动物实验研究均已表明AIT机体中IL-17呈高表达，在疾病过程中发挥促炎作用[9]，FIGUEROA V N，ZAKE T等临床研究亦发现桥本甲状腺炎患者IL-17表达升高[11-12]。

Ets-1是转录因子Ets家族成员之一，其作用具有两面性，可激活亦可抑制某些靶基因转录，并在许多自身免疫性疾病中发挥作用[13-14]，广泛参与多种免疫细胞的生长分化和调控多种细胞因子的表达[15-16]。MOISAN等研究显示Ets-1缺陷的Th细胞中分化Th17细胞的能力增强，同时可以显著增加Th17分化相关因子IL-17等的表达[7,17]，且有研究显示血清IL-17水平与Ets-1的两个风险性遗传变异呈强相关[15]，Ets-1通过影响Th17分化发挥其免疫调节功能的，高表达的Ets-1可以抑制IL-17，进而抑制免疫炎症反应。并且研究显示其他自身免疫性疾病的发生亦与Ets-1和IL-17的水平有关，如ZHANG J等通过对283例系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者血清IL-17水平的检测，发现SLE患者先天性Ets-1基因缺陷程度与IL-17浓度水平显著相关，并表明Est-1缺乏更易患SLE疾病[15]。进一步说明了Est-1在免疫疾病中的重要作用。

中医将此病归为“瘿病”范畴，中医病因与先天禀赋、体质因素相关，亦涉及饮食水土失宜、内伤情志等，各种致病因素影响中焦脾胃功能，使脾失卫外，脾失健运，湿浊不化，凝聚为痰，气机不通，血行不畅，结于甲状腺，发为本病。故“脾虚痰瘀”为本病核心病机。脾虚，脾失之卫，脾失健运，不能为胃行其津液，则出现湿浊内生免疫调控失衡，正如《灵枢》所云:“脾者，主为卫”，《医者续余·宗气营气卫气》所说:“卫气者，为言护卫周身……不使外邪侵犯也”。因此在本病的治法上，重视补脾气，创立“补气健脾、化痰消瘿、佐以活血”之法，应用自拟益气化痰活血方进行干预治疗。该方由8味药物组成，其中红参、黄芪为君药，以益气健脾，推动气血运行为主，使“气盛则痰消”；臣药为法半夏、浙贝母、生牡蛎、鳖甲，以软坚散结，化痰消瘿为用；佐以莪术、当归以活血化瘀，配合君臣，增加功效，诸药合用，既健脾益气以补本，又能化痰活血以祛标，以标本同治，攻补兼施。

本研究结果显示MG组AIT小鼠甲状腺IL-17 基因表达上调、Ets-1下调，YG-1、YG-2、YG-3组IL-17水平均显著下调，YG-2、YG-3组Ets-1显著上调，提示益气化痰活血方可能通过上调Ets-1的表达下调IL-17的表达来抑制免疫炎症反应，进而改善AIT小鼠甲状腺免疫失常状态。众所周知，免疫系统及免疫细胞调控是个复杂繁多的网络，Ets-1既可以负调控Th17分化，同时亦被其他因素调控，比如自身免疫疾病中异常表达的微小RNA参与的靶基因负调控。赵娜等[18-19]研究显示桥本甲状腺炎患者甲状腺组织和外周血单个核细胞中IL-17A和miR-326表达升高，进一步检测证实Ets-1降低，且Ets-1降低与miR-326和IL-17呈显著负相关，同样，其研究团队通过体外干预AIT易感NOD.H-2h4鼠脾脏单个核细胞、体内慢病毒尾静脉及甲状腺局部注射相关实验深入证实了AIT小鼠Ets-1显著下调，这儿与我们的结果一致，且其研究亦证实miR-326的过表达使Ets-1下调，miR-326可能通过负调控Ets-1水平促进Th17细胞分化参与AIT疾病过程。因此在后续的研究中我们有必要进一步拓宽思路，多方向、多角度验证中药作用的靶点，揭示中药作用机制。同样，机体IL-17表达水平受多种因素影响，比如维生素D代谢、肠道菌群、表观遗传学、其他免疫细胞等均可调控IL-17细胞水平，仅从某一基因单一角度探讨对其的调控及影响不够全面，因此仍需更合理全面的实验进行验证、关联，为探讨中药复方干预自身免疫性甲状腺疾病提供理论依据。