糌粑中β-葡聚糖、总多酚、总黄酮检测及分析
2020-09-30扎西穷达刘吉爱王军
扎西穷达，刘吉爱，王军
1. 西藏自治区食品药品检验研究院（拉萨 850000）；2. 中国农业大学食品科学与营养工程学院（北京 100083）
糌粑是用青稞炒熟后磨成粉状，是西藏传统特色食品。糌粑营养丰富，风味独特，在缺少瓜果蔬菜的高寒地区的人民经常食用，可解决人体营养缺乏症。对糌粑营养成分研究的相关报道较少，特别是对不同糌粑中关键营养功能指标的分析。糌粑作为藏区人民食用的重要主食之一，不仅为使用者提供能量（热量），还能提供提高免疫力等作用的功能因子，针对糌粑具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗癌等辅助功效[1]，分别选取β-葡聚糖，总多酚、总黄酮进行检测和分析。
1 材料与方法
1.1 试验材料
自制白糌粑、偏黑糌、水磨白糌粑、加豌豆糌粑、黑糌粑（购于西藏拉萨小昭寺附近）。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器与设备
超纯水仪（PURIST，上海乐枫生物科技有限公司）；分析天平（AL204-IC，感量0.000 1 g，梅特勒-托利多仪器有限公司）；紫外分光光度计（TU-1810D，北京普析通用仪器有限责任公司）；离心机（TDL-40B，3 500 r/min，上海安亭科学仪器厂制造）。
1.2.2 对照品和试剂耗材
芦丁（纯度＞99%）；没食子酸（纯度＞99%）；葡萄糖（纯度＞99%）；九水合硝酸铝；亚硝酸钠；无水乙醇；Folin-Ciocalteu（FC）试剂；Megazyme混联β-葡聚糖测定试剂盒；碳酸钠；氢氧化钠；冰乙酸；磷酸二氢钠；三水乙酸钠；超纯水（除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682规定的三级水要求）。
1.3 试验方法
1.3.1 黄酮含量测定[2]
1.3.1.1 仪器参考条件
检测波长510 nm。
1.3.1.2 分析步骤
1.3.1.2.1 标准曲线的配制
标准溶液储备液（0.15 mg/mL）配制：精密称取15 mg芦丁，用30%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀备用，即为芦丁标准溶液。
标准溶液系列配制：取0.050，0.100，0.200，0.400，0.500，0.800，1.00和3.00 mL标准溶液储备液（0.15 mg/mL），于10 mL比色管中，加入30%的乙醇溶液至5 mL，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，放置5 min后，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，反应6 min，加入2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液后，加水定容至10 mL。得到的标准曲线质量浓度分别为0.000 75，0.001 50，0.003 00，0.006 00，0.007 50，0.012 00，0.015 00和0.045 00 mg/mL。于510 nm波长下测定吸光度，根据测量标准使用液所产生吸光度，求得吸光度与浓度关系的一元线性回归方程。以质量浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准曲线：Y=9.166X+0.014 1，R2=0.998 6。
图1 黄酮标准曲线图
1.3.1.2.2 试样制备
糌粑样品（粉末状、干燥）取0.4 g样品加4 mL 80%乙醇，超声40 min，混匀离心后得到样品上清液，滤渣进行二次提取，合并2次提取液，并过0.45 μm有机相滤膜，得到提取液（V2）备用。分别吸取1.0 mL上述样品于10 mL（V1）比色管中，加入30%的乙醇溶液至5 mL，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，放置5 min后，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，反应6 min，加入2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液后，用超纯水定容至刻度线，测定其黄酮含量。以不加反应液的样品为空白样品。上机检测，得到样品的吸光度A。
式中：A为样品的吸光度（即Y=9.166X+0.014 1中的Y值）；X为样品中黄酮含量，mg/g；C为溶液单位质量浓度，mg/mL；V1为定容体积，mL；V2为提取液总体积，mL；m为样品质量，g。
1.3.2 多酚含量测定[3]
1.3.2.1 仪器参考条件
检测波长760 nm。
1.3.2.2 分析步骤
1.3.2.2.1 标准曲线的配制
标准溶液储备液（0.1 mg/mL）配制：取0.011 1 g没食子酸（1H2O合），于100.00 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线。
标准溶液系列配制：取0.100，0.200，0.500，0.800和1.000 mL标准溶液储备液（0.1 mg/mL），于10 mL容量瓶中，加入1.00 mL 50%的FC溶液和2.00 mL 15%碳酸钠溶液，用超纯水定容至刻度线，充分混匀后，室温下避光放置1 h，得到的标准曲线质量浓度分别为0.001，0.002，0.005，0.008和0.010 mg/mL。根据测量标准溶液系列所产生吸光度，求得吸光度与浓度关系的一元线性回归方程。以质量浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准曲线：Y=129.52X-0.011 2，R2=0.999 8。
图2 多酚标准曲线图
1.3.2.2.2 试样制备及检测
糌粑样品（粉末状、干燥），取0.3 g样品加4 mL 70%乙醇，超声30 min，混匀离心后得到样品上清液，滤渣进行2次提取，合并2次提取液，并过0.45 μm有机相滤膜，得到提取液（V2）备用。分别吸取1.0 mL上述样品于10 mL（V1）容量瓶中，加入1.00 mL 50%的FC溶液和2.00 mL 15%碳酸钠溶液，用超纯水定容至刻度线，充分混匀后，室温下避光放置1 h，测定其多酚含量。以不加反应液的样品为空白样品。上机检测，得到样品的吸光度A。
式中：A为样品的吸光度（即Y=129.52X-0.011 2中的Y值）；X为样品中多酚含量，mg/g；C为溶液单位质量浓度，mg/mL；V1为定容体积，mL；V2为提取液总体积，mL；m为样品质量，g。
1.3.3β-葡聚糖含量分析[4]
1.3.3.1 仪器参考条件
检测波长510 nm。
1.3.3.2 分析步骤
1.3.3.2.1 试剂的配制
50%乙醇溶液：取50 mL无水乙醇定容至100 mL。
20 mmol/L、pH 6.5磷酸盐缓冲溶液：称取3.12 g NaH2PO4·2H2O，加900 mL水溶解，用1 mol/L NaOH溶液调节至pH 6.5，定容至1 000 mL。
200 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液：取7.6 mL冰醋酸于900 mL水中，加入4.8 g三水乙酸钠溶解，调节至pH 4.0，定容至1 000 mL。
50 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液：取250 mL 200 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液稀释至1 000 mL。
1.000 mg/mL葡萄糖标准储存液：将葡萄糖粉末于100 ℃下常温干燥2 h，室温冷却后准确称取0.100 g干燥葡萄糖，用50 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液溶解并定容至100 mL。
50 U/mL地衣聚糖酶溶液：将Megazyme混联β-葡聚糖测定试剂盒中的地衣聚糖酶溶液用20 mmol/L、pH 6.5磷酸盐缓冲溶液稀释至20.0 mL。
2 U/mLβ-葡萄糖苷酶溶液：将Megazyme混联β-葡聚糖测定试剂盒中的β-葡萄糖苷酶溶液用50 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液稀释至20.0 mL。
葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-缓冲溶液：将Megazyme混联β-葡聚糖测定试剂盒中的葡萄糖氧化酶-过氧化物酶混合试剂50 mL稀释定容至1 000 mL。
1.3.3.2.2 操作步骤
葡萄糖标准工作液：平行移取100 μL葡萄糖标准储存液至3支试管中，分别添加100 μL 50 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液。
试剂空白：移取200 μL 50 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液至试管中。
样品称取：准确称取0.1～0.5 g（精确至0.000 1 g）待测样品，至于玻璃试管底部。
酶解前处理：向待测样品试管中添加0.2 mL 50%乙醇溶液，于涡旋混合仪上振荡分散；加入4.0 mL磷酸钠缓冲溶液，充分振荡后，将试管放入沸水浴中，保持1 min；取出试管，在涡旋混合仪上振荡数秒；沸水浴中继续保持2 min，振荡处理同前。
酶解反应：试管在50 ℃水浴中保温5 min，添加0.2 mL地衣聚糖酶溶液，混合均匀，室温下冷却5～10 min；以4 000 r/min离心10 min，取上清液，备用；分别移取0.1 mL上清液至3支试管底部，向其中2支试管中分别添加0.1 mLβ-葡萄糖苷酶溶液；另一支试管中添加0.1 mL 50 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液，作为反应空白，将上述试管在50 ℃下保温10 min。
显色反应：分别移取3.0 mL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-缓冲溶液至各试管（包括2个测试样、1个反应空白、3个D-葡萄糖标准工作液、1个试剂空白），50℃下反应20 min；取出试管，冷却至室温。
比色：以试剂空白调零，于510 nm处测定吸光度。如果试样中β-葡聚糖浓度大于10%，将产生比100 μL葡萄糖标准工作液高的吸光度。此时，需将备用上清液用适量50 mmol/L、pH 4.0乙酸钠缓冲溶液稀释，再进行后续步骤，结果计算时应把稀释因子考虑在内。
式中：ΔA为样品吸光度与反应空白吸光度的差值；F为吸光度转化为μg葡萄糖的转换因子，F=100 μg葡萄糖/100 μg葡萄糖的吸光度；94为体积校正因子；W为样品质量，g；0.9为葡萄糖转化成β-葡聚糖的脱水转换因子。
计算结果均保留至小数点后2位。
2 结果与分析
2.1 黄酮结果与分析
2.1.1 黄酮含量检测结果
以青稞为主要原料的糌粑中富含黄酮和各种对人体有益的活性成分。游离黄酮是糌粑中黄酮类物质的主要存在形式，黄酮类化合物具有抗衰老、抗真菌、抗癌、降血脂和保护心脑血管等多种药理活性[5]。
表1 糌粑中黄酮含量
2.1.2 黄酮含量结果的分析
黄酮是植物中非常重要的具有去自由基、抗氧化等功能的活性物质。以青稞为主要原料的糌粑中富含黄酮和各种对人体有益的活性成分。黄酮类化合物具有抗衰老、抗真菌、抗癌、降血脂等生物活性。对糌粑样品中的总黄酮含量分析发现，黄酮含量范围在2.90～6.80 mg/g之间，其中黄酮含量最低的是加豌豆糌粑2.90 mg/g，黄酮含量最高的是黑糌粑6.80 mg/g，见图3。糌粑中总黄酮和总酚含量丰富，高于小麦粉和豌豆粉，因此添加豌豆粉后其黄酮含量会呈现降低。
图3 糌粑中黄酮含量
2.2 多酚结果与分析
2.2.1 多酚含量检测结果
糌粑中含有多酚类物质，包括原花青素类等[6]，酚类物质的种类及含量在不同品种青稞中是不同的，游离的酚类一般为原花青素类和类黄酮。糌粑中富含的青稞多酚类化合物是重要的生物活性成分，具有抗氧化、活血化痰、清除自由基、抗衰老、增强免疫力等多种生理功能[7]。
表2 糌粑中多酚含量
2.2.2 多酚含量结果的分析
糌粑中的多酚类物质，包括原花青素类等，多酚类化合物是重要的生物活性成分，具有抗氧化、活血化痰、清除自由基、抗衰老等生理活性。多酚含量范围在0.583～1.50 mg/g之间，其中多酚含量最低的是加豌豆糌粑样品0.583 mg/g，含量最高的是黑糌粑样品1.50 mg/g，见图4。黑糌粑中含有花青素类物质，因此黑糌粑中的多酚类物质含量较为突出，这也是黑糌粑的重要特点。
图4 糌粑中多酚含量
2.3 β-葡聚糖结果与分析
2.3.1β-葡聚糖含量检测结果
20世纪60年代，研究逐渐发现β-葡聚糖具有降血脂、降胆固醇和预防心血管疾病的作用。β-葡聚糖的调节血糖、提高免疫力、抗肿瘤的作用也陆续被发现，引起全世界的广泛关注。β-葡聚糖作为一种非淀粉类碳水化合物——食用膳食纤维，本身能量低、糖分低。大量研究表明，富含β-葡聚糖的食品食用后增加肠道黏度、结肠处渗透、不易被人体消化吸收，消化器官中存在β-葡聚糖，可以促进胃肠蠕动，加快有害成分排出体外。β-葡聚糖能够减缓血液中葡萄糖含量的增加，从而在预防和控制糖尿病方面具有一定的治疗效果。用于制作糌粑的主要原料青稞中含有较丰富的β-葡聚糖，对调节血糖、提高免疫力、抗肿瘤具有重要价值，分析糌粑中β-葡聚糖的含量对区分和评价糌粑的品质具有重要参考作用[8]。
表3 糌粑中β-葡聚糖含量
2.3.2β-葡聚糖含量结果的分析
β-葡聚糖作为一种非淀粉类碳水化合物——食用膳食纤维，本身能量低、糖分低。富含β-葡聚糖的食品食用后增加了肠道黏度、结肠处渗透、不易被人体消化吸收，可以促进胃肠蠕动，加快有害成分排除体外。β-葡聚糖能够减缓血液中葡萄糖含量的增加，对调节血糖、提高免疫力、抗肿瘤具有一定作用。对样品分析发现，糌粑样品中β-葡聚糖含量范围在0.03%～5.98%之间（见图5），高于小麦粉、大米粉、豆粉等。因此添加豌豆的糌粑中含量最低，为 0.03%，而自制白糌粑由于精制工艺较少，其中含量较高，在分析的样品中自制白糌粑中的含量达5.98%，说明只用青稞制为原料，并且精制工序较少的糌粑中葡聚糖含量较高。β-葡聚糖的含量分析对糌粑精制情况、掺杂分析等品质分析都具有一定借鉴作用。
图5 糌粑中β-葡聚糖含量
3 结论
通过对糌粑样品中上述一些功能性成分相关的总多酚、总黄酮及β-葡聚糖含量指标检测及分析，黄酮含量最低的是加豌豆糌粑2.90 mg/g，黄酮含量最高的是黑糌粑6.80 mg/g；多酚含量最低的是加豌豆糌粑样品0.583 mg/g，含量最高的是黑糌粑样品1.50 mg/g；β-葡聚糖含量最低的是加豌豆的糌粑，为0.03%，自制白糌粑中的含量达5.98%。糌粑中总黄酮、总多酚和β-葡聚糖含量丰富，高于小麦粉和豌豆粉，因此添加豌豆粉后其黄酮、多酚及β-葡聚糖含量会呈现降低，黑糌粑中含有花青素类物质，因此黑糌粑中的总黄酮类和多酚类物质含量较为突出，这也是黑糌粑的重要特点，而自制白糌粑由于精制工艺较少，β-葡聚糖含量较高，说明只用青稞制为原料，并且精制工序较少的糌粑中葡聚糖含量较高。试验结果可有效评价糌粑的品质状况及掺杂等状况，对糌粑产品的监测、分析提供参考方法。
