不同种质黄果枸杞黄酮组分差异性

李越鲲，梁晓婕，王亚军，禄璐，周旋

宁夏农林科学院，枸杞工程技术研究所（银川 750002）

枸杞系茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium L.）多年生落叶灌木，全球约有80种，中国作为枸杞的主要起源中心，自然分布枸杞属植物共有7种3变种[1]。其中黄果枸杞（Lycium barbarum L. var. Auranticarpum K. F. Ching）是宁夏枸杞（Lycium barbarumL.）的变种[2]，其果实独特、色泽鲜亮、鲜食细腻、口感好，具有可观的市场前景和经济价值。但目前对黄果枸杞主要营养成分的提取与鉴定、深加工产品研发等方面的研究还处于起始阶段。

黄酮类化合物是枸杞的功效成分之一，具有明显的抗氧化、清除自由基、提高免疫力等作用[3-4]。课题组前期的研究结果表明黄果枸杞具有高黄酮的特性[5-6]。但对于不同黄果枸杞种质材料中黄酮类化合物的组分及含量仍不清楚。目前，对于枸杞中黄酮类化合物的测定方法已经成熟，常用的方法包括紫外分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、荧光分光光度法等[7-10]，为黄果枸杞黄酮类化合物的提取及应用奠定了良好的基础。

试验采用的超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱联用仪是可以同时定量和定性的分析系统，具有高分辨、高灵敏度等技术特点，用该检测系统对具有代表性的7份黄果枸杞种质材料进行黄酮组分的测定，为黄酮组分及其含量数据的精确性提供了有效保证。此外，对7份材料的黄酮组分及含量进行差异性比较分析，为黄果枸杞的开发利用及深加工产品的研发提供了一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 采样地概况

采样地位于宁夏银川市芦花台园林场枸杞种质资源圃试验区，地理位置为106°09′10″E，38°38′49″N，海拔1 114 m，年均温10 ℃左右，年平均降水量180 mm，全年平均日照时数超过3 000 h，0～30 cm土层的pH为7.90，全盐含量为0.72 g·kg-1，有机质含量为9.46 g·kg-1。

1.2 试验材料

供试材料为宁农杞5号（原编号W-12-30）、宁农杞4号（原编号W-13-29）、W-13-26、HZ-13-01、宁夏黄果、W-11-14和W-H-15-03共计7份黄果枸杞种质材料，树龄相同，栽培及田间管理方式一致，于2019年7月采集同一批新鲜的、无病虫害的果实作为供试样品。

1.3 试验方法

采用超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱联用技术测定黄果枸杞鲜果中的黄酮类活性成分。

1.3.1 供试品制备方法

取2 g打碎冻干的枸杞果实样品于10 mL离心管中，加入5 mL 50%甲醇水溶液，混合均匀后放入超声仪内35 ℃超声40 min，然后静置5 min，取上清液于1 mL离心管中，放入高速离心机中，以1 300 r/min离心10 min，过0.22 um微孔滤膜后装入1.5 mL自动进样瓶内，得到枸杞果实提取物。同样条件得到空白对照品。将样品放入4 ℃冰箱保存，在分析前取出（保存时间不能超过24 h）。

1.3.2 色谱条件

色谱仪器为岛津LC-30A。色谱柱为C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温为35 ℃；流速为0.5 mL/min；进样量为5 μL；流动相采用乙腈-0.1%甲酸水溶液的梯度洗脱程序，具体见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.3 质谱条件

质谱仪器为AB Sciex Triple TOF 5600+。

离子化模式为电喷雾正离子模式，离子源电压分别为5 500 V，离子源温度为600 ℃，去簇电压（DP）分别为100 V，碰撞能量（CE）分别为35 eV，碰撞能量扩展（CES）分别为15 eV。雾化气体为氮气，辅助气1为60 PSI，辅助气2为50 PSI，气帘气为40 PSI。一级质谱母离子扫描范围为50～1 000，IDA设置响应值超过100 cps的6个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为50～1 000，开启动态背景扣除（DBS）。

离子化模式为电喷雾负离子模式，离子源电压分别为-4 500 V，离子源温度为500 ℃，去簇电压（DP）分别为100 V，碰撞能量（CE）分别为-35 eV，碰撞能量扩展（CES）分别为15 eV。雾化气体为氮气，辅助气1为60 PSI，辅助气2为50 PSI，气帘气为40 PSI。一级质谱母离子扫描范围为50～1 000，IDA设置响应值超过100 cps的6个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为50～1 000，开启动态背景扣除（DBS）。

1.4 数据处理

使用Excel 2007软件和SPSS 23.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 黄果枸杞果实中黄酮组分种类

通过建立4 176种黄酮类活性成分数据库，采用飞行时间高分辨质谱对数据库中的活性成分匹配，定性分析枸杞果实中的黄酮类活性成分。样品溶液正、负离子模式下的总离子流图如图1和图2所示。

黄果枸杞果实提取物正负离子模式下检测到7大类共计42种活性成分，按每个化合物的质谱响应强度进行定量，由高到低排序依次为去甲丁香色原酮、芦丁、槲皮素、异黄酮素、苦参醇I、异槲皮苷、6-甲氧基山柰酚-3-O-芸香糖苷、茵陈色原酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、鸢尾黄素-7-O-木糖基葡萄糖苷、异水飞蓟宾、没食子儿茶素、苦参醇F、柳杉双黄酮A、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、落新妇苷、木犀草素、草质素、水飞蓟宾、去甲升麻素、4-羟基香豆素、二氢杨梅素、二氢桑色素、飞燕草素半乳糖苷、黄酮榕碱、葛根素-6’’-O-木糖苷、麦芽酚、光甘草酮、山奈酚、鬼臼毒醇、4’-O-甲基葛根素、木樨草素3’，7-二-O-葡糖苷酸、槲皮苷、2’’-O-p-香豆酰基牡荆素、桑根酮C、槲皮素-3-龙胆二糖苷、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、Corylifol A、二氢槲皮素、杨梅素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、（+）-没食子儿茶素。

2.2 黄果枸杞果实中黄酮组分差异性比较

从表2可以看出，7个品种（系）的黄果枸杞共检测出了5种黄酮组分，且不同品种（系）的含量互相之间存在差异。其中仅有宁夏黄果枸杞果实中含有黄酮榕碱这一成分，其它品种（系）的黄果枸杞果实中均不包含。此外，宁农杞4号枸杞果实中的木犀草素、木樨草素 3’，7-二-O-葡糖苷酸和2’’-O-p-香豆酰基牡荆素的含量均为最大，分别为1.32%，0.69%和0.63%，与其他品种（系）之间存在显著差异（p＜0.05）；W-13-26枸杞果实中的柳杉双黄酮A含量显著高于其他黄果枸杞品种（系）的含量（p＜0.05）。

图1 枸杞果实提取物正离子模式下与空白对照总离子流图

图2 枸杞果实提取物负离子模式下与空白对照总离子流图

表2 不同种质黄果枸杞黄酮组分差异

从表3可以看出，7个品种（系）的黄果枸杞共检测出了14种黄酮醇组分，且不同品种（系）的含量互相之间存在差异。其中异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、草质素以及槲皮素-3-龙胆二糖苷的含量在7个品种（系）的黄果枸杞之间不具有显著差异（p＞0.05），其它组分在品种间均具有差异。宁农杞4号在异水飞蓟宾、山奈酚、槲皮苷、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷以及槲皮素-7-O-葡萄糖苷5种含量上均显著高于其它品种（系）黄果枸杞果实的含量（p＜0.05），显示出了明显的优越性；W-13-26在异槲皮苷、6-甲氧基山柰酚-3-O-芸香糖苷、水飞蓟宾含量方面显著大于其他品种（系）的黄果枸杞；宁夏黄果中芦丁及槲皮素含量显著高于其他品种（系）（p＜0.05），宁农杞5号中杨梅素的含量显著高于其它品种（系）（p＜0.05）。

从表4可以看出，7个品种（系）的黄果枸杞共检测出了6种异黄酮组分。其中光甘草酮含量互相之间不存在显著差异（p＞0.05），但仅有宁农杞5号、宁农杞4号和宁夏黄果三个品种果实中含有该组分，其余黄果枸杞品种（系）中未检出该成分。葛根素-6’’-O-木糖苷在宁农杞5号及W-11-14枸杞果实中的含量较高，在W-H-15-03枸杞果实中的含量较低，同样在其余黄果枸杞品种（系）中未检出。其余4种异黄酮组分中，宁农杞4号果实中的异黄酮素含量最高（8.26%），W-H-15-03果实中的4’-O-甲基葛根素含量最高（0.66%），宁农杞5号果实中的Corylifol A含量最高（0.48%），而鸢尾黄素-7-O-木糖基葡萄糖苷在除W-13-26枸杞果实中的其他品种枸杞果实中的含量基本上相同，且不具有显著差异（p＞0.05）。

从表5可以看出，7个品种（系）的黄果枸杞共检测出了7种二氢黄酮醇组分。其中二氢桑色素含量在7个枸杞品种（系）中不存在显著差异（p＞0.05），而其他6种组分在品种（系）间均存在差异。苦参醇I、苦参醇F、落新妇苷、二氢杨梅素C15H12O8及桑根酮C的含量分别在W-13-26、HZ-13-01、W-13-26、W-11-14及宁农杞4号枸杞果实中最高，二氢杨梅素的含量则在宁农杞5号、HZ-13-01及W-11-14中最高，且彼此之间不存在显著性差异。

表3 不同种质黄果枸杞黄酮醇组分差异

表4 不同种质黄果枸杞异黄酮组分差异

表5 不同种质黄果枸杞二氢黄酮醇组分差异

从表6可以看出，7个品种（系）的黄果枸杞共检测出了1种二氢黄酮醇组分，即补骨脂二氢黄酮甲醚，其中W-13-26枸杞果实中的含量显著高于其他枸杞品种系（3.41%）（p＜0.05），其他品种系枸杞果实中的补骨脂二氢黄酮甲醚含量不存在显著差异（p＞0.05）。在黄烷醇方面，7个品种（系）的黄果枸杞共检测出了3种组分，分别是没食子儿茶素、飞燕草素半乳糖苷及（+）-没食子儿茶素。其中（+）-没食子儿茶素这一组分仅存在于宁夏黄果中（0.40%），其他黄果枸杞品种（系）中不存在该成分；飞燕草素半乳糖苷这一成分在7种黄果枸杞品种（系）中不存在显著差异；在没食子儿茶素含量方面，仅W-13-26黄果品系显著低于其他黄果枸杞品种（系）（p＜0.05），其他6个品种（系）的黄果枸杞中该含量互相之间不具有显著差异（p＞0.05）。

从表7可以看出，7个品种（系）的黄果枸杞共检测出了6种类黄酮的其他物质，其中仅有2种物质（去甲丁香色原酮、去甲升麻素）在7份黄果枸杞材料中均有检出，其它检出物质中茵陈色原酮仅存在于宁夏黄果和W-11-14枸杞果实中，且互相之间不存在显著差异（p＞0.05）；4-羟基香豆素存在于宁农杞4号、W-13-26、HZ-13-01及W-H-15-03四个黄果枸杞品种（系）中，且宁农杞4号枸杞果实中的含量（1.32%）显著高于其他品种（系）；麦芽酚及鬼臼毒醇则分别在宁农杞5号（0.76%）及宁农杞4号（0.92%）枸杞果实中含量最高。

表6 不同种质黄果枸杞二氢黄酮及黄烷醇组分差异

表7 不同种质黄果枸杞其他物质差异

3 结论

首次采用超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱联用技术对7份黄果枸杞种质材料的黄酮组分进行了测定，并对各组分含量进行了差异性分析。结果表明：黄果枸杞含有7大类42个黄酮组分；其中23个是7份黄果枸杞材料共有的，19个组分仅存在于个别黄果枸杞材料中；在种类方面，宁夏黄果中黄酮组分最多，为35种，且黄酮榕碱和（+）-没食子儿茶素为其独有；在含量方面，宁农杞4号表现出了明显的优势，有16种组分均显著高于其他黄果枸杞材料（p＜0.05）。此次试验明确了有代表性的黄果枸杞种质材料中黄酮的组成特性，为进一步研究黄果枸杞黄酮类化合物的活性及深加工产品的开发利用奠定了基础。