硝酸银-硅胶柱层析法分离纯化华山松籽油亚油酸

郭剑霞，张谨华，潘玉峰

晋中学院生物科学与技术学院（晋中 030619）

华山松（Pinus armandi Franch）是中国特有树种，其籽平均含油率为56.5%，其中亚油酸含量最高，达57.7%。亚油酸是重要的功能性多不饱和脂肪酸，具有许多重要的生理功能[1-2]。亚油酸能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化。高纯度亚油酸是人和动物营养中必需的脂肪酸，具有降血脂及防治心脑血管疾病等功能。但人体不能合成亚油酸，只能从油脂中获得[3-4]。

用于多不饱和脂肪酸（PUFAs）分离纯化的主要方法有超临界流体精馏法[5]、分子蒸馏法[6]、尿素包合法[7]、银离子配位法[8]、吸附分离法等[9]。其中吸附分离法中的硝酸银-硅胶柱法具有操作方便、设备简单等优点。尤其对碳链数目相近的不饱和脂肪酸分离效果甚为明显[10]。

硝酸银-硅胶柱层析色谱分离法常用于多不饱和脂肪酸及其甲酯的分离纯化[11]。硅胶层析时加入硝酸银后可以改变硅胶表面的吸附性能，增大层析分辨率，提高分离效果。由于吸附在硅胶上的银离子与不饱和脂肪酸分子中的—C＝C—之间发生电子迁移形成π络合物，从而改变了各饱和度不同的脂肪酸在吸附剂（硝酸银-硅胶）上的分配系数，使之得以分离[12]。

试验以硝酸银-硅胶H为吸附剂，探究硝酸银-硅胶柱层析法中重要因素对华山松籽油中亚油酸分离纯化的影响，为从华山松籽油中分离亚油酸提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

华山松籽仁（吉林省派诺生物技术有限公司，经超临界CO2萃取制得华山松籽油）。

无水硫酸钠、95%乙醇、石油醚（沸程30～60℃）、丙酮、甲醇、硫酸、氢氧化钾、盐酸等（均为分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯）；混合脂肪酸甲酯标准品（纯度＞99.5%，美国Sigma公司）。

HA 221-50-06超临界萃取装置；RE-5203A型旋转蒸发器；PHS-3 C型酸度计；日本岛津GC2010气相色谱仪，配备火焰离子化检测器（FID）。

1.2 试验方法

1.2.1 华山松籽油混合脂肪酸（PFA）的制备

参考文献[13]中的方法。称取50.0 g华山松籽油于烧瓶中，加入200 mL 4%氢氧化钾-95%乙醇溶液，用磁力搅拌器缓慢搅拌升温至75 ℃，皂化回流2 h至皂化完全。加入一定量温水，继续搅拌30 min使其皂化物充分溶解，在反应液中缓慢加入20%盐酸调节约pH 2，继续恒温搅拌15 min，分液漏斗分出油层，加入适量石油醚溶解，并用温水洗涤有机层至中性，加入适量无水硫酸钠脱水，过滤，60 ℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂肪酸混合液（PFA），称其质量。

1.2.2 硅胶预处理

将硅胶经110 ℃ 烘20 h活化，在正己烷中浸泡24 h，经超声波脱气后用于柱层析。

1.2.3 硝酸银硅胶的制备

参照文献[14]的方法，稍作修改。称取20.0 g活化后硅胶，加入6.0 g硝酸银、20 mL蒸馏水和30 mL 95%乙醇，剧烈振荡。将混合液转移入旋转蒸发烧瓶中（瓶用铝箔包裹），在70 ℃水浴下减压旋转蒸发，最后形成流动样粉末，停止蒸发。将所制得硝酸银硅胶于110 ℃烘20 h以上，即为层析用硝酸银硅胶。

1.2.4 银化硅胶对脂肪酸的吸附动力学曲线的绘制

参照文献[14]的方法。准确称取0.25 g硝酸银硅胶，加入60 mL质量浓度55 mg/mL的PFA-正己烷溶液中，25 ℃下避光恒温搅拌，每隔0.5 h测定一次上清液中的总脂肪酸质量浓度（mg/mL）。分析混合脂肪酸吸附量随时间变化趋势，得到混合脂肪酸的吸附动力学曲线，同时计算相应间隔时间内混合脂肪酸的平均吸附速率。总脂肪酸浓度的测定参考GB/T 5530—2006。

1.2.5 装柱

选用层析柱规格（35 cm×1.8 cm），分离效果以洗脱液中亚油酸相对百分含量为指标。称取12.0 g活化后的硝酸银硅胶，加入80 mL正己烷，搅拌，排除气泡，静置2 h，使硅胶充分溶胀。匀浆法装柱。在层析柱底部预先放入脱脂棉，加入20 mL正己烷，将溶胀的银化硅胶缓慢倾入，柱外用锡纸包裹，装完后垫上一层滤纸，加适量无水硫酸钠，打开旋塞，用正己烷洗柱平衡2 h后使用。

将层析柱中多余正己烷从柱底排出，待层析柱内液面略高于硅胶面0.5 cm时开始上样。在硅胶面上放一块滤纸以防止加样时冲坏上样面。将一定质量PFA溶解到5 mL洗脱溶剂中，上样，用滴管缓慢滴加到层析柱内，注意不要使硅胶面有浮动。进行洗脱，定体积收集洗脱液。

1.2.7 洗脱

经多次反复试验，确定洗脱体系为含有丙酮的正己烷混合液，按照丙酮在正己烷中的浓度分别为0%，3%，5%，7%，9%（洗脱2次）和11%（洗脱2次）顺序进行洗脱，其中每一浓度100 mL，以0.8～1.0 mL/min洗脱流速进行梯度洗脱，每40 mL收集液为1个样品，按收集顺序编号。

1.2.8 脂肪酸回收

洗脱液每40 mL收集1管，将收集到的各流分按先后顺序依次编号，旋蒸除去洗脱剂，用2 mL正己烷溶解，加入适量饱和NaCl水溶液，振摇1 min，静置分层，除去下层残渣及氯化银沉淀与废液，取有机相通过装有无水硫酸钠的漏斗，滤液于60 ℃水浴中减压回收溶剂，即得脂肪酸样品。密封置棕色瓶中-20 ℃保存，用于气相色谱分析。

1.2.9 气相色谱分析

1.2.9.1 脂肪酸甲酯的制备

为进行气相色谱分析，需要对脂肪酸进行甲酯化处理，甲酯化的目的主要是为减少分子间形成氢键，同时减少分子的极性，使其更容易气化，从而缩短分析时间，也保证峰与峰之间有效的分离度。在烧瓶中称取0.1 g脂肪酸样品，70 ℃水浴锅中甲酯化30 min，同时加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液。后加入2 mL异辛烷，加入蒸馏水至瓶颈口，静置分层，选取异辛烷层进行气相色谱分析。

“摆谱”，源自东北话。19世纪初期，东北移民屯垦时，老辈人家都有家谱，大家常坐到一块“摆谱”，看看谁家的“谱大”，出身显赫，有傲人资本。后来，“摆谱”引申为故意摆出某种姿态显示给别人看。譬如摆门面，摆架子，摆阵势，无非是证明自己是名人、显贵、阔佬，以满足可怜且可笑的虚荣心。

1.2.9.2 分析方法

气相色谱仪分析脂肪酸甲酯。分析条件为：PEG-2M毛细管柱，0.31 mm×25 m；柱温190 ℃；检测器温度250 ℃；气化室温度250 ℃；载气N2；流速37 mL/min；氢气25 mL/min；空气100 mL/min；进样量0.5 μL。

2 结果与分析

2.1 上样量对华山松籽油亚油酸分离纯化效果的影响

上样量直接影响层析柱的分离性能，样品过载程度过大，会严重降低分离效率，甚至使色谱柱失去分离能力；上样量不足，样液浓度低，扩散作用大，也可造成分离效率低[15]。研究不同上样量对多不饱和脂肪酸纯度的影响，其结果如图1所示。使用35 cm×1.8 cm的层析柱，按照脂肪酸与吸附剂的质量比分别为1∶8，1∶15和1∶30上样进行洗脱，绘制PUFAs亚油酸的洗脱曲线，收集洗脱下来的亚油酸，测定其纯度，结果如图1所示。

上样量分别选取1∶8，1∶15和1∶30（脂肪酸与吸附剂的质量比）进行洗脱，绘制不同上样量的洗脱曲线。从图1可以看出，上样量与吸附剂质量比1∶8时，色谱柱过载，所得流分中亚油酸的最高含量为87.02%，分离结果比较差。上样量1∶30时，得到的亚油酸纯度较高。但由于上样量1∶30时上样量太小，脂肪酸浓度太低，亚油酸与固定相结合紧密，需要大量洗脱液才能将其洗脱下来，分离效能下降。因此，就PFA的纯化而言，确定PFA与吸附剂质量比1∶15较佳（即上样量0.8 g脂肪酸）。考虑到试验要求和硝酸银成本问题，最终选定上样量与吸附剂质量比1∶15。

图1 上样量对亚油酸含量的影响

2.2 不同浓度洗脱剂对华山松籽油亚油酸纯度的影响

称取12.0 g活化好的硝酸银-硅胶，采用湿法填充于35 cm×1.8 cm玻璃柱中，锡箔纸包住玻璃柱避光以防止硝酸银氧化分解。将0.8 g混合脂肪酸溶解到5 mL洗脱溶剂中，上样，用不同体积分数的丙酮-正己烷溶液依次洗脱，得到PFA分离产物。研究硝酸银-硅胶柱层析纯化华山松籽油亚油酸的洗脱结果，以丙酮-正己烷溶液作为洗脱剂，每40 mL收集1次组分，共得到11种组分，旋转蒸发仪除去洗脱剂、水洗3次后加入无水硫酸钠脱水，加正己烷复溶，利用气相色谱检测各部分流出液中脂肪酸的组成，结果如表1所示。

表1为利用不同体积比的丙酮-正己烷溶液作为色谱柱洗脱剂通过色谱柱分离提纯后的脂肪酸种类。正己烷为非极性溶剂，对于饱和脂肪酸有较好的洗脱力，加入丙酮调节极性后，较适合亚油酸、油酸及亚麻酸等不饱和脂肪酸的彻底洗脱。正己烷具有洗脱饱和脂肪酸时速度快、洗脱效果彻底等优势[16]，洗脱体系中丙酮含量的多少对亚油酸和油酸的洗脱效果有明显影响。以正己烷作为洗脱剂时，几乎所有的不饱和脂肪酸（亚油酸、亚麻酸和油酸）均可被银化硅胶吸附，只有少量饱和脂肪酸被吸附。这是因为不饱和脂肪酸中双键数目越多，与Ag+结合力越强。同时，脂肪酸的极性也随着双键数目增加而增加，因此，按照相似相容的原理，增加洗脱剂的极性有助于将吸附在银化硅胶上的PUFAs洗脱下来。洗脱液开始用0%（丙酮在正己烷中浓度）洗脱剂，随后改变洗脱剂浓度，使丙酮在正己烷中浓度逐渐增加到3%，5%，7%，9%和11%继续剩余不饱和脂肪酸的洗脱。

由于饱和脂肪酸（C16∶0、C18∶0和C20∶0）不含双键，与固定相银化硅胶结合力弱，这些脂肪酸用较多的非极性溶剂就可以大量被洗脱，因此，最先从层析柱中洗脱下来。数据显示，不被银离子吸附的棕榈酸、硬脂酸和花生酸等饱和脂肪酸及少量未被吸附剂吸附的不饱和脂肪酸主要存在于正己烷相中。单不饱和脂肪酸油酸（C18∶1）能用稍大极性的洗脱剂洗脱。油酸主要被丙酮-正己烷（3%）洗脱。由于单不饱和脂肪酸含有一个双键，与银化硅胶的结合力稍强，增加洗脱剂的极性后开始被洗脱下来。亚油酸在最初洗脱时的数量很少，洗脱剂浓度为5%（丙酮在正己烷中的浓度）时纯度明显提高。随着丙酮体积分数增加，溶剂洗脱体系极性增加，多不饱和脂肪酸在组分中的含量随之增加。在整个洗脱过程中，棕榈酸、硬脂酸和花生酸首先被洗脱下来，在40 mL流出液中棕榈酸、硬脂酸和花生酸的含量达到28.10%，31.46%和38.31%。油酸和亚油酸的含量分别在200和440 mL中达到峰值，分别为74.22%和98.12%。由表1可知，棕榈酸、硬脂酸和花生酸的洗脱趋势相近，两者在溶剂洗脱过程中被同时洗脱下来。油酸是影响硝酸银-硅胶柱纯化华山松籽油亚油酸效果的主要因素，如何提高油酸与亚油酸的分离度，是提高华山松籽油亚油酸纯度的关键。

表1 硝酸银-硅胶柱层析纯化脂肪酸的洗脱结果（PFA与吸附剂质量比1∶15）

图2为不同浓度洗脱液进行洗脱时，以各样品中的亚油酸相对含量（%）对流出液体积（mL）作混合脂肪酸与吸附剂质量比1∶15时的洗脱曲线图。

硝酸银-硅胶柱层析分离多不饱和脂肪酸主要基于银离子可以与—C＝C—形成络合物，且双键数越多，脂肪酸的极性越强，与银离子的结合越牢固。不同极性的有机溶剂具有不同的洗脱能力，可将脂肪酸从硝酸银-硅胶载体上洗脱下来[17]。试验用非极性溶剂正己烷将与银化硅胶结合力较弱的饱和与部分单不饱和脂肪酸洗脱下来，接着在正己烷中加入一定量丙酮增加其极性，进一步将PUFAs亚油酸洗脱下来并收集。

华山松籽油亚油酸在不同时期洗脱液中的含量变化如图2所示。洗脱液体积160 mL时，亚油酸开始被洗脱下来，曲线呈上升趋势；洗脱液体积440 mL时，亚麻酸全部被洗脱下来，洗脱液中亚麻酸含量98.12%。由于亚油酸有2个双键，与银化硅胶的结合力较强，较难被洗脱。饱和脂肪酸与银化硅胶结合较弱，用非极性洗脱剂就可以被洗脱下来。为得到高纯度的PUFAs亚油酸，利用银化硅胶层析法可消除饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸油酸的影响，但需要增加洗脱剂的极性。试验中发现，5%丙酮-正己烷洗脱液可将大部分的亚油酸洗脱出来，因此，可先用0%，3%和5%丙酮正己烷洗脱，再用高含量的丙酮-正己烷洗脱液洗脱，减小试剂消耗。由于亚油酸有两个双键，吸附较强，最终被强极性的丙酮剥离，9%丙酮-正己烷洗脱液将亚油酸全部洗脱下来。由皂化和酸解所得混合脂肪酸的亚油酸的得率为89.7%，亚油酸含量达到98.12%。试验表明硝酸银-硅胶柱层析络合分离具有选择性。银离子在凝胶上的负载也会影响溶质的保留时间，因为负载决定固体基质上银离子的表面密度，与洗脱剂极性共同作用，这样就使得硝酸银-硅胶柱层析络合分离具有高选择性[18]。

图2 华山松籽油亚油酸洗脱曲线图

2.3 洗脱液气相色谱分析

由于样品在气相中传递速度快，因此，样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间达到平衡。可选作固定相的物质很多，因此，气相色谱法分析速度快且分离效率高。采用12.0 g银化硅胶装柱，上样0.8 g混合脂肪酸，依次用100 mL正己烷，浓度3%，5%，7%，9%和11%的丙酮-正己烷溶液各100 mL进行洗脱。对分离后的脂肪酸组成进行气相色谱分析，结果见图3和图4。

将硝酸银硅胶柱对亚油酸的分离纯化效果用气相色谱法进行测定，结果见图3，图4和表2。由图3和图4可以看出，华山松籽油经硝酸银-硅胶柱分离纯化，亚油酸纯度得到提高，亚油酸与饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸得到有效分离。

Sajilata等[19]报道了银离子可与烯烃形成络合物，而且这个过程可逆。根据华山松籽油亚油酸中含有2个不饱和双键的特点，选取硝酸银-硅胶作为吸附剂，探讨硝酸银-硅胶柱层析分离纯化亚油酸的效果，结果表明分离效果较理想。由于硝酸银能与烯键的π电子相互作用，改变硅胶的吸附特性，因此，硝酸银-硅胶对亚油酸的吸附力强于油酸和饱和脂肪酸。洗脱液中加入丙酮后，洗脱液极性相应增加，将吸附较弱的棕榈酸、硬脂酸及花生酸从硝酸银-硅胶的表面活性中心上解吸下来，极性较强的溶剂逐渐将吸附稍强的油酸解吸，达到分离亚油酸和油酸目的。从表2可以看出，分离产物中亚油酸相对含量由原来的57.7%提高到98.12%。结果表明，采用分离纯化工艺可获得高纯度亚油酸。

图3 脂肪酸标准品气相色谱图

图4 华山松籽油亚油酸柱层析精制后色谱图

表2 脂肪酸标准品与柱色谱分离后样品脂肪酸组成

2.4 PFA的吸附动力学曲线

温度保持一定时，吸附量与时间的关系可以绘制出吸附动力学曲线，它是描写吸附过程最常用的基础数据。准确称取0.25 g银化硅胶，加入60 mL质量浓度为55 mg/mL的PFA-正己烷溶液，25 ℃恒温避光振荡，每隔0.5 h测定1次上清液中总脂肪酸浓度（mg/mL）及其中亚油酸的相对含量，分析PFA的吸附量随时间变化趋势，得到PFA的吸附动力学曲线，同时计算相应间隔时间内PFA的平均吸附速率（见图5和图6）。

硝酸银-硅胶柱色谱是根据脂肪酸成分中双键的多少和位置不同，与硝酸银形成π络合物难易程度和稳定性的差别而进行层析分离的。Snyder等[20]的研究结果表明，吸附过程受溶剂相中强溶剂浓度的影响，因此，可通过改变溶剂相组成中强溶剂的浓度改变洗脱效果。油酸、亚油酸、亚麻酸为极性物质，在硝酸银-硅胶上的竞争吸附能力较强，根据溶质和吸附剂的特性，选择非极性溶剂正己烷和极性略强的丙酮组成混合洗脱液，进行动态吸附试验。

研究硝酸银-硅胶的吸附特性及银化硅胶对脂肪酸的平均吸附速率曲线，其结果如图5和图6所示。从PFA的吸附动力学曲线（图5）可以看出，随着吸附时间延长，吸附量不断地增加，约2.5 h后达到平衡，达到平衡时的吸附量为87.6 mg/g。银化硅胶对PFA的平均吸附速率曲线（图6）显示，银化硅胶对多不饱和脂肪酸的吸附性能良好，2.0 h即可达到吸附平衡。由于银化硅胶对多不饱和脂肪酸具有良好的吸附性能，因此它可作为一种优良的吸附剂，用来分离纯化多不饱和脂肪酸。吸附速率在前2.0 h迅速降低，之后逐渐缓和，至平衡后，几乎不再下降，基本符合单分子层吸附理论。吸附动力学曲线大体上可分为5种类型[21]。华山松籽油混合脂肪酸在硝酸银-硅胶上的平均吸附速率曲线是Langmuir型，表明华山松籽油混合脂肪酸在硝酸银-硅胶上基本属于单分子层吸附。Langmuir理论模型描述的是单分子层的理想吸附。该假定是基于固体表面均一，一个吸附位置只能吸附一个分子的被吸附组分，各组分分子的面积大小相同，形成一个二维的理想溶液，并假定吸附分子在吸附剂固体表面上各占一个吸附位置，它们之间没有横向相互作用。固体吸附剂在洗脱溶液中的吸附动力学曲线普遍是Langmuir型[22]。

图5 银化硅胶对脂肪酸的吸附动力学曲线

图6 银化硅胶对脂肪酸的平均吸附速率曲线

3 结论

在硝酸银-硅胶柱色谱法精制华山松籽油亚油酸的研究中，通过对银化硅胶吸附特性的研究及柱分离曲线的绘制，确定硝酸银-硅胶柱色谱分离纯化PUFAs亚油酸的最佳条件。在12 g活化的银化硅胶色谱柱中，加入与吸附剂比例1∶15的脂肪酸，以丙酮-正己烷作为洗脱剂，可以有效地将华山松籽油中亚油酸分离出来，洗脱液浓度9%时，洗脱完毕，洗脱液中亚油酸含量达到98.12%。银离子硅胶柱色谱选择性较高，与分离前华山松籽油中亚油酸相比，纯度提高40.4%。硝酸银化硅胶使华山松籽油中亚油酸的纯度得到大幅提高，该方法简单易行，可大规模分离纯化亚油酸。因此，硝酸银-硅胶柱层析法是一种较理想的分离纯化亚油酸的方法。银化硅胶对脂肪酸的吸附符合单分子层吸附理论。