6个破壁灵芝孢子粉的理化性质

弓志青 ，孟楠楠，王文亮 *

1. 山东省农业科学院农产品研究所（济南 250100）；2. 山东省农产品精深加工技术重点实验室（济南 250100）；3. 农业部新食品资源加工重点实验室（济南 250100）

灵芝（Ganoderma lucidum）是担子菌纲多孔菌科灵芝科灵芝属真菌，是一种食药两用的真菌，具有抗肿瘤、调节免疫等作用[1-2]。灵芝孢子是灵芝生长成熟时从菌盖弹射出来的淡雾状的极其微小的孢子，具有双壁结构，外被坚硬的几丁质纤维素所包围，人体很难充分吸收，破壁后更适合人体肠胃直接吸收。灵芝孢子粉中含有多种活性物质，如多糖、三萜类、甾醇类等，具有调节免疫[3-4]、抑制肿瘤[5-6]、保肝解毒[7]、降三高[8-10]等功效。我国是世界上灵芝主要的生产国和出口国，2017年灵芝产量16.68万 t，占全球产量的75%。山东是灵芝的四大主产区之一，占全国灵芝产量的1/4，主要集中在聊城冠县，以代栽为主，其次为泰安灵芝，以段木栽培为主。

灵芝孢子粉多糖、破壁率、重金属含量等直接影响其品质。励炯等[11]研究发现部分市售破壁灵芝孢子粉存在重金属超标、破壁率不达标及杂质掺混情况。张芝华[12]对灵芝孢子粉营养成分包括多糖、三萜、核苷、甾醇等进行了比较研究，发现不同品种孢子粉营养成分具有显著差异。

为更好地了解山东省不同栽培方式及不同破壁方式灵芝孢子粉理化特性，以我省段木及代栽破壁灵芝孢子粉的6个样品为原料，对其理化性质包括水分含量、粗脂肪、多糖、重金属、扫描电镜等进行比较，为灵芝孢子粉生产和精深加工提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝孢子粉样品，共6个，取自山东省冠县和济南基地，以GL-S 1～6来表示，其中GL-S1和GL-S6为段木栽培，其余为代栽，GL-S，GL-S2和GL-S3为撞击式破壁，其余3种为碾压式破壁，品种为赤芝（表1）。

苯酚、浓硫酸、硝酸、无水乙醇、石油醚、氢氧化钠、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、DNS溶液等均为分析纯。

表1 孢子粉原材料表

1.2 仪器与设备

GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SZF-06索氏抽提器，杭州汇尔仪器设备有限公司；电子天平，奥豪斯仪器有限公司；5804R离心机，Eppendorf股份公司；UV-6100紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；BT-9300S激光粒度分布仪，丹东百特仪器有限公司；SIGMA 300扫描电镜，蔡司公司；iCAP Qc电感耦合等离子体质谱仪，美国Thermo Fisher科技有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；VORTEX-6电动震荡器，上海其林贝尔有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水分含量

参照GB 5009.3—2016干燥法进行测定。

1.3.2 粗脂肪含量

参照GB 5009.6—2016索氏提取法进行测定。

1.3.3 总糖

称取样品，各0.500 g，置于50 mL离心管中，沸水浴提取2 h，冷却至室温，以10 000 r·min-1离心5 min，取上清液，用苯酚-硫酸法测定总糖含量。

1.3.4 还原糖

分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL葡萄糖标准液（1 mg·mL-1）于15 mL试管中，用蒸馏水补足至1.0 mL，分别准确加入2 mL DNS试剂，沸水浴加热2 min，流水冷却，用水补足到15 mL刻度，在520 nm波长下测定吸光度。

取上述样品上清，各2 mL，分别加入2 mL DNS试剂于25 mL具塞试管中，空白对照为2 mL蒸馏水，迅速振荡摇匀，沸水浴5 min，冷水冷却至室温，定容至25 mL，静置30 min后于520 nm检测。

1.3.5 多糖

食用菌中粗多糖含量的测定参照于华峥等[13]的方法。分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的标准葡萄糖工作溶液，置于20 mL具塞玻璃试管中，用蒸馏水补至1.0 mL，向试液中加入1.0 mL 6%的苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，静置10 min，使用旋涡振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于100 ℃水浴中15 min，在490 nm处测吸光度。以葡糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定标准曲线。

准确称取样品，各1.000 g，置于50 mL具塞试管中，用5 mL水浸润样品，缓慢加入20 mL无水乙醇，同时使用旋涡振荡器振荡，混合均匀，置超声提取器中超声提取30 min。提取结束后，以4 000 r·min-1离心10 min，弃去上清。不溶物用10 mL 80%的乙醇溶液洗涤、离心。用水将上述不溶物转移50 mL具塞离心管中，加入50 mL蒸馏水，在沸水浴中提取2 h。冷却至室温，过滤，将上清转移至100 mL容量瓶中，残渣洗涤2～3次，洗涤液转移至容量瓶中，加水定容。此溶液为样品测定液。

1.3.6 重金属含量

参照GB 5009.268—2016。称取0.2～1.0 g（精确至0.001 g）固体干样于消解内罐中，加入5 mL硝酸，放置过夜，放入恒温干燥箱中消解，于160 ℃消解4 h，冷却至室温后，将消解内罐取出，在控温电热板上，于100 ℃加热30 min，用水定容至25 mL，进行充分混合后备用，同时做空白试验。

将待测样液和空白试液分别注入电感耦合等离子体发射光谱仪中，测定待测元素分析谱线强度的信号响应值，根据标准曲线得到消解液中待测元素的浓度。

1.3.7 粒度分布

采用激光法进行样品粒度分布的测定，取适量样品置于激光粒度分析仪的样品槽中，使样品平铺均匀。按下激光粒度分析仪上吸尘、送气、进样键，激光粒度分析仪自动测量粒径分布结果。

1.3.8 灵芝孢子粉破壁率检测

根据GB/T 29344—2011血球计数法，观察孢子粉显微结构。

1.3.9 扫描电镜

利用电子枪发射电子束，经聚焦后在试样表面作光栅状扫描，通过检测电子与试样相互作用产生的信号对试样表面的成分、形貌及结构等进行观察和分析。

1.3.10 统计分析

数据采用SPSS、Excel分析方法进行方差分析，采用邓肯氏多重检测确定数据间差异性，每个样品重复测定3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 灵芝孢子粉含水率及粗脂肪含量

6个样品灵芝孢子粉中含水量及粗脂肪结果见表2。灵芝孢子粉含水量在2.013%～7.922%之间，GL-S3含量最高，为7.922%，不同样品之间含水量具有差异显著；孢子粉中的粗脂肪含量在27.12%～34.05%之间，不同样品间具有显著差异，其中冠县代栽的灵芝孢子粉GL-S2含量最高，为34.05%。根据中华人民共和国供销合作行业标准关于“灵芝破壁孢子粉”的规定，其含水量应低于9%，说明山东省灵芝孢子粉水分含量达标。赵晓燕等[14]研究结果表明5个破壁灵芝孢子粉粗脂肪平均含量为33.34%，与此次试验结果一致。据文献[15-16]报道，灵芝孢子粉中脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，主要是油酸和亚油酸。

表2 灵芝孢子粉营养成分分析 %

2.2 样品中总糖、多糖及还原糖含量

6个样品灵芝破壁孢子粉中的总糖、还原糖和多糖含量见表2。孢子粉总糖含量在4.359%～5.769%之间，其中代栽的GL-S1和GL-S4总糖含量较高，还原糖含量在0.196%～0.247%之间。多糖含量在0.879%～1.182%之间，其中GL-S4多糖含量最高，为1.182%，段木栽培的两个样品GL-S1和GL-S6的多糖含量低于代栽的GL-S4含量，且具有显著差异，而与其它样品间无显著差异，这与孢子粉的品种、加工工艺有密切相关。根据中华人民共和国供销合作行业标准关于“灵芝破壁孢子粉”的规定，其粗多糖含量应大于等于0.8%，说明山东省灵芝破壁孢子粉多糖含量满足行业标准。

一般认为，段木栽培灵芝多糖含量高于代栽灵芝多糖含量，这是由于段木栽培灵芝生长期比代栽灵芝生长期长。郭爱玲等[17]研究大段木灵芝、小段木灵芝及袋料灵芝的多糖含量，发现段木灵芝子实体中多糖含量高于代栽子实体多糖含量。

2.3 重金属含量

灵芝对重金属的吸附能力较强，另外在破壁加工过程中，也有可能被污染，因此对6个灵芝破壁孢子粉样品中的3种重金属含量进行检测，结果见表3。镉含量在0.11～0.186 mg·kg-1之间，其中GL-S1中含量最高，为0.186 mg·kg-1；铅含量在0.039 4～0.243 mg·kg-1之间，其中GL-S3的含量最高，为0.243 mg·kg-1；砷含量在0.055～0.12 mg·kg-1之间，其中GL-S1的含量最高，为0.12 mg·kg-1，说明山东省破壁灵芝孢子粉重金属含量安全问题较为满意。王伟影等[18]比较了市售20个灵芝孢子粉中As、Hg、Pb、Cr的含量，发现部分样品Pb、Cr超标。

灵芝孢子粉重金属含量还没有国家标准，因其属于保健食品一类，根据食品安全国家标准（GB 16740—2014），每千克样本中砷含量不超过1.0 mg，铅含量不超过2.0 mg。根据食品中污染物限量的国标（GB 2762—2012），重金属镉的含量参照食用菌制品，每千克含量不超过0.5 mg，可以看出6个样品中镉、铅、砷含量均符合规定。其中，GL-S1的镉和砷含量最高，GL-S3中铅含量最高，这与它们的破壁方式有关，GL-S1、GL-S3是撞击式破壁，孢子粉与机械直接接触的重大撞击力，使接触面中重金属溶出，导致孢子粉中重金属含量增高。

2.4 粒度分布

灵芝孢子粉破壁后，破碎的孢壁与内容物混合在一起，6个破壁灵芝孢子粉的体积平均径D[4,3]和D50见表4。破壁灵芝孢子粉的D[4,3]在6.042～7.91 μm之间，D50在5.723～6.284 μm之间，其中GL-S3的D[4,3]和D50最大，且不同样品之间D[4,3]和D50有显著差异。碰撞式破壁的3个样品GL-S1、GL-S2、GL-S3的D[4,3]和D50大于碾压式的3个样品GL-S4、GL-S5、GL-S6的粒径，说明碾压式破壁的孢子粉破碎更充分，破壁方式对孢子粉粒度影响较大。

表3 灵芝孢子粉中镉、铅、砷含量 mg/kg

表4 不同样品灵芝孢子粉的粒径

2.5 光镜和扫描电镜

从图1可以看出，GL-S1、GL-S3、GL-S5、GL-S6 4个样品在光镜下破壁率都很高，达95%以上，破壁率均符合GB 29344—2012关于“灵芝破壁孢子粉采收和加工技术规范”中破壁率应高于95%的规定。

图1 灵芝孢子粉光镜图（400倍）

灵芝孢子粉表层质地坚硬，是由几丁质和葡聚糖构成的孢壁（图2），未破壁赤芝孢子粉呈宽卵圆形，顶端平截，表面有一定数量的小洞和坑洼[1]，代栽灵芝孢子粉粒径为（8.6～8.8 μm）×5.6 μm，而GL-S1和GL-S6段木栽培的孢子粉粒径为8.8 μm×6.6 μm，细胞壁厚度为0.8～1 μm，段木栽培孢子粉与代栽孢子粉相比，长度相差不大，而宽度较宽，颗粒更加饱满。采用不同的粉碎设备破壁后，孢子粉表层的层网结构被破坏，但采用碾压式设备粉碎的孢子粉GL-S5和GL-S6破坏程度更大，破碎率达100%，已无可见完整颗粒，而GL-S1、GL-S3采用碰撞式粉碎设备可见部分完整颗粒的轮廓，尤其是GL-S3破壁率较低，未达到GB 29344—2012中破壁率应高于95%的规定。GL-S3体积平均粒径最大，与扫描电镜结果一致，也可以说明碾压式的破碎方式破壁效果较差。

图2 灵芝孢子粉扫描电镜图（3 000倍）

3 结论与讨论

对山东省6个灵芝破壁孢子粉的理化性质研究发现，灵芝破壁孢子粉中水分、粗多糖、重金属等指标均满足中华人民共和国供销合作行业标准，但个别采用碾压式破壁的孢子粉破壁率低于90%，低的破壁率影响孢子粉的营养吸收。近年来随着低温碰撞式破碎设备的出现，灵芝孢子粉破壁效果更好，达到100%，高的破壁率可提高孢子粉的免疫活性[19]。GB 29344—2012中规定采用血球计数法测定孢子粉破壁率，但此次试验发现光镜下观察到的孢子粉破壁率达95%以上，但电镜下个别样品破壁率低于95%，因此建议找正规厂家购买孢子粉。

扫描电镜发现段木栽培灵芝孢子粉比代栽孢子粉更饱满，可能是段木栽培时间长，营养储备充足，但段木栽培孢子粉多糖含量并未高于代栽孢子粉多糖，关于两种栽培方式多糖调节免疫及抗肿瘤等活性高低，还需要进一步研究。另外，受段木栽培灵芝重茬、木头资源少等因素的影响，段木栽培孢子粉产量低、价格高。

此次试验还采用液相色谱检测了孢子粉中灵芝酸a和b的含量，但并未检测到。于华峥等[13]比较了灵芝子实体、菌丝体和孢子粉的化学成分，发现未破壁的孢子粉中基本测不到灵芝三萜，与此次试验结果一致。但也有一些研究发现孢子粉中含有灵芝三萜[20-22]。灵芝中多糖和三萜在调节免疫和抗肿瘤上起共同作用，一些研究发现灵芝精粉比灵芝孢子粉的免疫功能强[23-24]，也有一些研究发现灵芝子实体和孢子粉热水提取物的免疫刺激活性相当[25-26]。

山东省代栽和段木栽培的破壁灵芝孢子粉中多糖、含水量、重金属等含量符合中华供销总社灵芝孢子粉理化性质的行业标准，扫描电镜发现段木栽培比代栽孢子粉更饱满，但个别样品破壁率未达标。此次试验为灵芝孢子粉生产和精深加工提供依据。